多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及分析检测技术领域，具体讲，涉及一种多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用。试剂盒包括：分别偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒、分别偶联有待测真菌毒素抗体的磁性纳米颗粒、真菌毒素的标准品溶液；待测真菌毒素至少包括玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1。本发明专利技术的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性好等优点，对多种真菌毒素的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。超灵敏检测技术具有很好的指导意义。

【技术实现步骤摘要】
多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及分析检测
，具体讲，涉及一种多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用。

技术介绍

[0002]食品安全问题日益受到全球的广泛关注。特别地，其中最普遍、危害最大的是真菌毒素。真菌毒素是在一定温度和湿度条件下，由真菌产生的次级代谢产物和非蛋白小分子化合物。它们分布广泛，种类繁多，毒性强，检测困难，并且同一种污染的食物中可能存在多种毒素。伏马毒素(fumonisin B1，FB1)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是普遍存在于玉米、燕麦、小麦等谷类和乳制品中的两种真菌毒素。它们往往会引起人类和动物急性中毒、慢性中毒、致畸和致癌，不可避免地、广泛持续影响着人类的健康。因此，人们越来越关注食品和饲料中的真菌毒素污染。
[0003]目前常用的检测真菌毒素的方法包括色谱法、免疫检测法、电化学检测法、拉曼光谱检测法等。其中，气相色谱法(gas chromatography，GC)、薄层色谱法(thin
‑
layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high
‑
performance liquid chromatography，HPLC)等灵敏度高、特异性好，是分析领域公认的确证性检测方法，但是耗时、仪器昂贵，样品前处理繁琐并且依赖专业人员，难以应用到现场检测；其他方法灵敏度一般，且普遍操作较为复杂。随着纳米材料和纳米技术的迅速发展，为进一步提高真菌毒素检测传感器的灵敏度和便捷性并用于现场检测提供了巨大的可能性。
[0004]因此，建立一种快速、高效、灵敏的真菌毒素检测方法，对食品安全快速检测具有重要意义。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要专利技术目的在于提供一种多种真菌毒素的检测试剂盒。
[0007]本专利技术的第二专利技术目的在于提供该多种真菌毒素的检测试剂盒的制备方法。
[0008]本专利技术的第三专利技术目的在于提供一种多种真菌毒素的检测方法。
[0009]本专利技术的第四专利技术目的在于提供上述试剂盒和方法的应用。
[0010]为了完成本专利技术的专利技术目的，采用的技术方案为：
[0011]本专利技术第一方面提出一种多种真菌毒素的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
[0012]分别偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒；分别偶联有待测真菌毒素抗体的磁性纳米颗粒；真菌毒素的标准品溶液；所述待测真菌毒素至少包括玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1；所述抗体优选单克隆抗体。
[0013]本专利技术第二方面提出该试剂盒的制备方法：
[0014]其中，所述偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒的制备方法至少包括以下
步骤：
[0015]采用戊二醛法，用链霉亲和素修饰氨基化上转换纳米颗粒，得到链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒；
[0016]将链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒与生物素化的待测真菌毒素人工抗原孵育；
[0017]优选的，上转换纳米颗粒的浓度为2mg/mL，生物素化的待测真菌毒素人工抗原的浓度为1.5mg/mL；
[0018]更优选的，所述孵育的温度为37℃，孵育的时间为4～8小时。
[0019]本专利技术第三方面提出多种真菌毒素的检测方法，采用上述试剂盒中的试剂，至少包括以下步骤：
[0020]S1、绘制标准曲线：
[0021]将一系列浓度梯度的所述真菌毒素标准品溶液分别与所述偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入所述偶联有真菌毒素单抗的磁性纳米颗粒进行结合，磁分离，收集上清，检测上清中不同真菌毒素所对应的荧光信号，建立真菌毒素标准品浓度与荧光信号的标准曲线；
[0022]S2、检测待测样品：
[0023]将待测样品与所述真菌毒素标准品混合，制备得到混合待测样品；将所述混合待测样品与所述偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入所述偶联有真菌毒素单抗的磁性纳米颗粒进行结合，磁分离，收集上清，检测上清中不同真菌毒素所对应的荧光信号；
[0024]S3、根据标准曲线计算待测液中真菌毒素的浓度。
[0025]本专利技术至少具有以下有益的效果：
[0026]本专利技术利用上转换纳米颗粒独特的发光特性，抗体的特异性和磁纳米颗粒的分离富集效应。不仅可以同时检测两种真菌毒素，而且在免疫检测过程中避免了自体荧光的干扰，有效地提高了分析的准确性和灵敏度。因此，本专利技术的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性好等优点，对多种真菌毒素的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。
附图说明
[0027]图1为本专利技术的检测原理图；
[0028]图2为两种上转换纳米颗粒(UCNPs)透射电镜图；
[0029]图3为两种不同发光的UCNPs与生物素标记的FB1和ZEN毒素抗原偶联后的XPS表征图；
[0030]图4偶联前的磁性纳米颗粒SEM表征图；
[0031]图5为磁性纳米颗粒偶联FB1毒素抗体后的SEM表征图；
[0032]图6为磁性纳米颗粒偶联ZEN毒素抗体后的SEM表征图；
[0033]图7为磁性纳米颗粒与FB1和ZEN毒素单克隆抗体偶联后的XPS表征图；
[0034]图8为以FB1和ZEN标准品的浓度为横坐标，各浓度对应的荧光强度为纵坐标绘制的标准曲线；
[0035]图9为基于磁分离和双色上转换的高灵敏度免疫荧光传感器用于同时检测伏马毒
素B1和玉米赤霉烯酮的特异性实验；
[0036]图10为偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒的体积筛选试验结果；
[0037]图11为反应体系的缓冲液种类筛选试验结果；
[0038]图12为反应体系的pH筛选试验结果；
[0039]图13为反应竞争时间筛选试验结果。
具体实施方式
[0040]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0041]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0042]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0043]本专利技术实施例第一方面提出一种真菌毒素的检测试剂盒，可同时检测多种真菌毒素，包括以下组分：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多种真菌毒素的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：分别偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒；分别偶联有待测真菌毒素抗体的磁性纳米颗粒；真菌毒素的标准品溶液；优选地，所述待测真菌毒素至少包括玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1；更优选地，所述抗体为单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述上转换纳米颗粒选自直径为25～30nm的颗粒；优选NaYF4:Yb
3+
,Tm
3+
或NaYF4:Yb
3+
,Er
3+；
。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述上转换纳米颗粒和所述磁性纳米颗粒保存于0.01M PBS中，pH优选为7.0。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，偶联有伏马毒素B1抗原的上转换纳米颗粒的浓度为2mg/mL，和/或，偶联有伏马毒素B1单抗的磁性纳米颗粒浓的度为2mg/mL，和/或，偶联有玉米赤霉烯酮抗原的上转换纳米颗粒的浓度为2mg/mL，和/或，偶联有玉米赤霉烯酮单抗的磁性纳米颗粒的浓度为2mg/mL。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，标准品溶液为一系列浓度梯度的标准品溶液，浓度为0.05～5ng/mL。6.如权利要求1～5任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒的制备方法至少包括以下步骤：采用戊二醛法，用链霉亲和素修饰氨基化上转换纳米颗粒，得到链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒；将链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒与生物素化的待测真菌毒素人工抗原孵育；优选的，上转换纳米颗粒的浓度为2mg/mL，生物素化的待测真菌毒素人工抗原的浓度为1.5mg/mL；更优选的，所述孵育的温度为37℃，孵育的时间为4～8小时。7.一种多种真菌毒素的检测方法，采用权利要求1～5任一项所述的试剂盒中的试剂，至少包括以下步骤：S1、绘制标准曲线：将一系列浓度梯度的所述真菌毒素标准品溶液分别与所述偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩铁，高志贤，李双，王瑜，李静芝，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：