一种功能性树枝状DNA、基于该树枝状DNA的纳米传感探针及该纳米传感探针的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种功能性树枝状DNA、基于该树枝状DNA的纳米传感探针及该纳米传感探针的应用。本发明专利技术提供的功能性树枝状DNA作为一种简单可靠的多功能纳米支架，可以用于制备纳米传感探针。该纳米传感探针能够结合24倍之多的血红素分子、在支架上形成24个DNAzyme，使其具备化学发光信号放大能力；与此同时，AgNPs被共价修饰在支架的末端，通过设计AgNPs与DNAzyme之间的DNA长度、使两者距离满足5～20nm进一步实现MEC效应，最终达到化学发光的双重放大，确保提升该材料的光学性能。该纳米传感探针可以用于心血管疾病多组分生物标志物的高灵敏化学发光免疫检测和细胞内相关蛋白的化学发光成像。白的化学发光成像。白的化学发光成像。

【技术实现步骤摘要】
一种功能性树枝状DNA、基于该树枝状DNA的纳米传感探针及该纳米传感探针的应用


[0001]本专利技术属于分析化学领域，涉及一种新型纳米传感探针，具体涉及一种功能性树枝状DNA、基于该树枝状DNA的纳米传感探针及该纳米传感探针的应用。

技术介绍

[0002]等离子体共振增强发光原理可用于放大光学信号和提高光学检测灵敏度，近年来引起广泛关注，这一效应主要发生在金、银等贵金属及其纳米材料上。只要金属与发光物质满足两个条件：(1)金属的吸收峰和发光物质的发射峰存在重叠，(2)金属与发光物的距离介于5～20nm之间，那么发光物质的能量就可以通过近场作用被转移到金属表面的自由电子上，使之集体震荡并产生与发光物质相似的发射光谱，从而增强发光强度。
[0003]然而，近年来大部分研究都集中于等离子体共振增强荧光(metal enhanced fluorescence,MEF)上，对于等离子体共振增强化学发光(metal enhanced chemiluminescence,MEC)的文章大部分还处于探索机理阶段，在高灵敏化学发光免疫分析中应用较少，在细胞胞内化学发光成像则更少。化学发光和荧光的主要区别是：发光物质来源于化学反应、不需要外接光源，即属于自发光、因而可以避免入射光散射光的干扰，分析更灵敏，操作更简单。
[0004]如前所述，为了达到最佳的MEC效果，发光物质与金属之间应满足一定距离；迫切需要开发可靠的支架，以低成本、高效、可控的方式将发光物和金属精准隔离。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种功能性树枝状DNA、基于该树枝状DNA的MEC纳米传感探针及该纳米传感探针的应用。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]一种功能性树枝状DNA，由Y0、Y1、Y2、Y3、Y4、Y4l这6种DNA的Y型结构按照摩尔比1Y0:3Y1:6Y2:12Y3:(23Y4+1Y4l)依次混合反应制备得到；其中，Y0由如下核苷酸序列的Y0a、Y0b、Y0c等摩尔比混合反应制备得到，Y1由如下核苷酸序列的Y1a、Y1b、Y1c等摩尔比混合反应制备得到，Y2由如下核苷酸序列的Y2a、Y2b、Y2c等摩尔比混合反应制备得到，Y3由如下核苷酸序列的Y3a、Y3b、Y3c等摩尔比混合反应制备得到，Y4由如下核苷酸序列的Y4a、Y4b、Y4c等摩尔比混合反应制备得到，Y4l由如下核苷酸序列的Y4a、Y4b、Y4p等摩尔比混合反应制备得到；
[0008]Sequences of oligonucleotides(5'
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3')
[0009][0010]一种基于上述功能性树枝状DNA的纳米传感探针，在树枝状DNA的Y4a与Y3a、Y3b形成的G四链体结构上结合血红素hemin形成DNA酶DNAzyme，在树枝状DNA的Y4b、Y4c末端标记氨基上结合银纳米粒子AgNPs。
[0011]一种上述纳米传感探针的制备方法：常温下，取过量1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、N
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羟基琥珀酰亚胺将AgNPs的羧基活化1h，取1.0mL AgNPs，用0.4M NaOH调节溶液pH为9.0，缓慢加入640μL 170.2nM所述功能型树枝状DNA，不断搅拌，混合孵育18h；随后，将10μL 10μM SH
‑
A15加入溶液，封闭2h；将122μL 0.01M PBS加入到溶液中继续反应6h，接着缓慢加入21μL 2M NaCl，3h后重复该步骤，12h后缓慢加入26μL 2M NaCl，3h后重复该步骤，使AgNPs能够耐盐而不改光学性质，继续反应48h；未组装的DNA通过离心除去，沉淀溶于1.0mL 20mM KCl与200mM NaCl的混合溶液；最后加入一定量的hemin，常温避光搅拌反应2h以形成hemin/G四链体DNA酶；未组装的DNA和过量的hemin通过离心除去，弃去上清液，沉淀溶于1.0mL 20mM KCl与200mM NaCl的混合溶液，使用前在4℃暗处保存。
[0012]优选地，上述制备方法中，所述银纳米粒子通过如下方法制备：在柠檬酸三钠存在时，使用还原剂NaBH4来还原AgNO3生成银纳米粒子。
[0013]更优选地，上述制备方法中，银纳米粒子具体制备方法为：10mL 1mM AgNO3逐滴加入冰浴的30mL 2.0mM NaBH4和2mL 34mM柠檬酸三钠中，室温下搅拌反应30min至溶液呈亮黄色，使用前在4℃暗处保存。
[0014]优选地，上述制备方法中，离心除去未组装的DNA的离心参数为15000rpm、15min、14℃；离心除去未组装的DNA和过量的hemin的离心参数为15000rpm、15min、4℃。
[0015]上述纳米传感探针在制备检测心血管疾病多组分生物标志物的化学发光免疫检测试剂方面的应用。
[0016]优选地，所述生物标志物包括肌钙蛋白T和糖类蛋白125。
[0017]上述纳米传感探针在制备对细胞内相关蛋白进行化学发光成像的试剂方面的应用。
[0018]优选地，所述细胞内相关蛋白包括萤火虫荧光素酶。
[0019]有益效果：
[0020]1、本专利技术提供的功能性树枝状DNA(FDD)作为一种简单可靠的多功能纳米支架。在FDD内部，分别于特定位置设计了两个G四链体结构的分裂片段，它们单独不起作用，靠近则能协同捕获hemin分子形成G四链体/hemin模拟酶(DNAzyme)，DNAzyme可以模拟辣根过氧化物酶的活性、催化过氧化氢氧化鲁米诺的化学发光，从而扮演了发光物质的角色。鉴于鲁米诺
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鲁米诺CL体系的发射峰为～425nm，银纳米粒子(AgNPs)具有最合适的光谱重合度和最有效的表面等离子体共振，所以选择AgNPs为本实验的金属材料、结合在FDD的末端、并通过设计AgNPs和DNAzyme之间的“间隔DNA”的序列长度，来调控AgNPs与DNAzyme的距离，起到等离子体共振增强化学发光(MEC)的作用。
[0021]2、本专利技术提供的MEC纳米传感探针具有以下优点：(1)该探针是DNA组装而来，原料易得，制备工艺简单。(2)DNAzyme可以克服自然酶稳定性低、修饰困难等缺点。此外，只有在FDD组装成功时才形成完整的DNAzyme，其它时候分裂酶不能捕捉hemin形成DNAzyme、因此提供较低背景。(3)FDD支架有效地携带了所有的内部DNAzyme，具有良好的细胞通透性，使MEC纳米传感探针能够用于细胞内分析物的检测。(4)间隔物的设计很容易；由于每3个DNA碱基长度约1nm，可在DNAzyme和AgNPs之间方便地通过调节DNA序列长度来控制距离，获得最佳的MEC效应。
附图说明
[0022]图1为探针FDD/hemin/AgNPs的结构(A)和等离子体共振增强化学发光原理(B)；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种功能性树枝状DNA，其特征在于：由Y0、Y1、Y2、Y3、Y4、Y4l这6种DNA的Y型结构按照摩尔比1Y0:3Y1:6Y2:12Y3:(23Y4+1Y4l)依次混合反应制备得到；其中，Y0由如下核苷酸序列的Y0a、Y0b、Y0c等摩尔比混合反应制备得到，Y1由如下核苷酸序列的Y1a、Y1b、Y1c等摩尔比混合反应制备得到，Y2由如下核苷酸序列的Y2a、Y2b、Y2c等摩尔比混合反应制备得到，Y3由如下核苷酸序列的Y3a、Y3b、Y3c等摩尔比混合反应制备得到，Y4由如下核苷酸序列的Y4a、Y4b、Y4c等摩尔比混合反应制备得到，Y4l由如下核苷酸序列的Y4a、Y4b、Y4p等摩尔比混合反应制备得到；2.一种基于权利要求1所述功能性树枝状DNA的纳米传感探针，其特征在于：在树枝状DNA的Y4a与Y3a、Y3b形成的G四链体结构上结合血红素hemin形成DNA酶DNAzyme，在树枝状DNA的Y4b、Y4c末端标记氨基上结合银纳米粒子AgNPs。3.一种权利要求2所述纳米传感探针的制备方法，其特征在于：常温下，取过量1
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(3
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐、N
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羟基琥珀酰亚胺将AgNPs的羧基活化1h，取1.0mLAgNPs，用0.4M NaOH调节溶液pH为9.0，缓慢加入640μL 170.2nM所述功能型树枝状DNA，不断搅拌，混合孵育18h；随后，将10μL 10μM SH
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A15加入溶液，封闭2h；将122μL 0.01M PBS加入到溶液中继续反应6h，接着缓慢...

【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，宗晨，王瑞珂，李飞，杨华，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：