一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶、基因及表达制备方法技术

本发明专利技术公开了一种专一性转化橙皮苷生成橙皮素

【技术实现步骤摘要】
一种
α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶、基因及表达制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，涉及一种序列改良的α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶(突变体)、编码基因及表达制备方法，该α
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L
‑
鼠李糖苷酶突变酶能够专一转化橙皮苷生产橙皮素
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O
‑
葡萄糖苷。

技术介绍

[0002]橙皮素
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O
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葡萄糖苷，分子式为C
22
H
24
O
11
，是由橙皮苷脱掉1分子鼠李糖后的产物，是橙皮苷/橙皮素衍生物，非糖部分都是橙皮素。橙皮素7
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O
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葡萄糖苷的水溶性是橙皮苷的50倍，其生物利用度比橙皮苷好，橙皮素7
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O
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葡萄糖苷开环加氢后是一种新型低热值甜味剂，即橙皮素二氢查耳酮的单葡萄糖，是一种新型甜味剂的前体物质。目前，橙皮素7
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O
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葡萄糖苷的制备方法有化学法和生物转化法。化学法的制备条件难以控制，且目标产物容易进一步水解为橙皮素，从而使得目标产物得率较低，且易对环境造成严重污染；而酶法生物合成的条件温和，不会引起橙皮苷母核结构的变化。
[0003]柑橘黄酮粗提物中含有大量黄酮糖苷类化合物，包括橙皮苷及新橙皮苷。目前，主要是利用α
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L
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鼠李糖苷酶水解橙皮苷或新橙皮苷制备橙皮素7
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O
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葡萄糖苷。α
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L
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鼠李糖苷酶[E.C.3.2.1.40]可作用于黄酮糖苷类物质中α
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1、α
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1,2、α
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1,3、α
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1,4、α
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1,6糖苷键连接的L
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鼠李糖。当α
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L
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鼠李糖苷酶作用于柑橘黄酮粗提物时，不仅产生橙皮素7
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O
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葡萄糖苷，还会有其他副产物生成。以含橙皮苷或新橙皮苷的柑橘黄酮粗提物为原料制备橙皮素7
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O
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葡萄糖，需先将原料纯化成橙皮苷或新橙皮苷，再经过α
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L
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鼠李糖苷酶水解，再进一步纯化为橙皮素7
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O
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葡萄糖，需要经过2次纯化及2次浓缩结晶才能制备得到橙皮素7
‑
O
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葡萄糖，该工艺复杂，得率低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于制备专一性转化橙皮苷的α
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L
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鼠李糖苷酶，可用于将柑橘粗提物中的橙皮素特异性转化为橙皮素7
‑
O
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葡萄糖苷，避免其他副产物的生成，避免二次纯化，节约成本。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案包括：
[0006]一种编码α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]一种α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶，所述突变酶由所述基因编码，所述突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]所述基因的突变方法为，采用基因工程技术手段对从原始菌株黑曲霉JMU
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TS528中克隆得到的α
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L
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鼠李糖苷酶r
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Rha1进行定向进化，得到突变酶S303R的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(1968bp)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(655个氨基酸残基)。
[0009]一种表达制备所述α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶的方法，表达载体为pPIC9k
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S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导终浓度为0.5％，诱导温度为30℃。
[0010]对所述α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶进行表达制备，包括采用所述的α
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L
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鼠李糖苷酶S303R表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组α
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L
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鼠李糖苷酶S303R。其中，表达载体为pPIC9k
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S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导浓度为0.5％，诱导温度为30℃。
[0011]与其他相关酶相比，本专利技术提供的α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶S303R在催化含有橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、枸橘苷等成分的黄酮粗提取物时，可特异性转化橙皮苷，没有其他副产物生成，且转化率大幅度提高。该方法制备橙皮素
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O
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葡萄糖苷具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好等优点，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0012]图1为本专利技术实施例2α
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L
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鼠李糖苷酶WT及S303R的SDS
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PAGE图。其中，M：分子量标准蛋白；1：纯化后的WT；2：纯化后的S303R。
[0013]图2为根据本专利技术实施例4的WT及S303R最适温度曲线图。
[0014]图3为根据本专利技术实施例4的WT及S303R最适pH曲线图。
[0015]图4为根据本专利技术实施例5、6、7及对比例1、2、3的WT及S303R针对柑橘黄酮粗提物的底物特异性统计图。
具体实施方式
[0016]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。
[0017]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0018]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0019]下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种α
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L
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鼠李糖苷酶突变酶，其特征在于，所述突变酶由权利要求1所述的基因编码，所述突变酶的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪辉，李利君，孙江，李文静，龚建业，李清彪，姜泽东，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：