一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法技术

一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法，以“红、橙、黄、绿、蓝”五色量子点荧光作为背景信号，五色量子点分别与牛血清白蛋白偶联后，再分别与五种真菌毒素检测抗原混匀喷涂在试纸条检测区域；银纳米粒子分别与五种真菌毒素的单克隆抗体结合作为量子点激发光的内滤探针。当检测样品中某种真菌毒素含量大于等于国家限量标准时，对应的荧光信号打开，可裸眼直观判读五种真菌毒素是否符合国家标准。本发明专利技术制备的试纸条可用于同时快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等五种真菌毒素。真菌毒素。真菌毒素。

【技术实现步骤摘要】
一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法


[0001]本专利技术涉及快速检测
，具体涉及一种基于裸眼观测的多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条，即基于银纳米粒子对多色量子点激发光的内滤作用构建免疫层析试纸条，快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等五种真菌毒素。

技术介绍

[0002]我国是粮食生产和消费大国，加强粮食的质量控制意义重大。农作物在种植、采收、加工、运输和储藏过程中，容易被真菌污染，在温湿度适宜的条件下，某些真菌的产毒菌株会产生一类小分子次级代谢产物，即真菌毒素，给人类和动物带来严重的健康风险。对食品中真菌毒素实施监管和制定限量标准是保证食品安全的重要措施。
[0003]我国食品安全国家标准（2017）对谷物中四种真菌毒素制定了限量要求：黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）5~20
µ
g/kg、赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）5
µ
g/kg、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）60
µ
g/kg和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）1000
µ
g/kg。此外，由于伏马菌素（Fumonisin）的毒性及污染的严重性，2019年食品安全国家标准真菌毒素限量征求意见稿中增加了伏马菌素B1，B2和B3总量的限量要求：玉米、玉米面（渣）和含有玉米原料的谷物制品限量分别为4000、2000和1000<br/>µ
g/kg。建立同时检测上述真菌毒素的高灵敏快速检测方法具有重要的现实意义。
[0004]免疫层析方法因具有操作简便、快速、抗基质干扰能力强等优点，是现场快速筛查的常用方法。免疫层析方法针对真菌毒素等小分子待检物的分析，通常为竞争反应模式。即检测线（T线）上固定的检测抗原与待检物共同竞争信号物质上标记的抗体，检测信号强度与待检物含量成反比关系。定性或半定量分析通常以T线上“信号消失”作为判读标准，当待检物数量较多时才能使信号物质上标记的抗体处于饱和状态而不被T线上的检测抗原“捕获”。因此，基于“信号消失”模式的免疫层析方法的定性或半定量分析灵敏度不高。构建基于“信号打开”模式的竞争免疫层析技术，即检测信号随着小分子待检物浓度增大从无到有，可显著提高方法学检测灵敏度。
[0005]近年来一些研究小组尝试了基于胶体金的荧光猝灭竞争免疫层析模式，在这种模式中，荧光材料作为背景信号固定在检测线（T线）上，或者喷涂在整个硝酸纤维素膜（NC膜）的检测区域。当样品溶液中无待检物时，金标抗体泳动至T线与检测抗原结合导致荧光猝灭；当样液中存在痕量待检物时，被T线捕获的金标抗体数量减少，导致T线荧光信号打开。该方法与传统的竞争免疫层析相比，荧光信号随着待检物浓度增大从无到有，可显著提高检测灵敏度。如Fu等建立了基于胶体金和荧光素间荧光共振能量转移（FRET）的“信号打开”型免疫层析方法，用于检测重金属铬离子和克伦特罗（瘦肉精），检测限较传统的“信号消失”模式降低了十倍以上。
[0006]FRET是距离很近（10纳米以内）的两个荧光物质间或者荧光物质与能量受体之间产生的一种能量转移现象。其产生条件为供体荧光物质的发射光谱与受体的吸收光谱重
叠，并且两个分子的距离在10纳米以内。如果需要同时检测多种目标物，且各种待测物以不同颜色加以区别，基于FRET的信号打开模式的竞争免疫层析需要使用多种吸收光谱的纳米探针以对应不同颜色荧光物质的发射光谱，而不同吸收光谱的纳米粒子在形貌、大小、生物相容性、适合的pH值及缓冲液盐浓度等方面存在较大差异，很难在同一试纸条上统一使用。此外，考虑到抗体本身的尺寸（8至10nm），基于抗原抗体结合的免疫学检测体系不会有较高的FRET效率。针对基于FRET的信号打开模式的竞争免疫层析不适合于多色荧光指示的多重检测。
[0007]内滤效应（IFE）是指贵金属纳米粒子对荧光物质特定激发光或发射光强烈的吸收效应，与FRET相比，其不受10nm的距离限制，而且可以作用于荧光物质激发光。银纳米粒子的摩尔消光系数远高于胶体金，是IFE体系理想的吸收剂；量子点具有荧光产率高、光稳定性好、激发光谱宽而发射光谱窄且对称以及随粒径变化呈现不同色彩的光谱等优点，是IFE体系理想的荧光剂。在免疫层析试纸条上利用银纳米粒子吸收光谱与多色量子点激发光谱有效重叠，结合银纳米粒子的强消光特性，通过IFE将银纳米粒子数量呈指数关系地转化为多色量子点的荧光信号，可实现免疫层析试纸条上多种小分子待检物的多色荧光“信号打开”模式的高灵敏、快速、同时检测。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提出一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法，采用银纳米粒子作为“红、橙、黄、绿、蓝”多色量子点激发光的共同内滤剂，建立基于IFE的多色荧光“信号打开”型竞争免疫层析检测方法，实现谷物中AFB1、OTA、ZEN、DON和FB1五种真菌毒素的同时、高灵敏及快速裸眼检测。
[0009]本专利技术是通过以下技术方案实现的。
[0010]本专利技术所述的一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备及使用方法，包括如下步骤。
[0011]（1）银内滤探针制备。
[0012]在1000mL体系中调整柠檬酸钠浓度至5mM，单宁酸0.025mM，剧烈搅拌下加热至沸腾，加入10mL 25mM硝酸银，溶液变成亮黄色。移出200mL反应液，反应体系中再加入170mL水，温度设定90℃，加入5mL 25 mM柠檬酸钠，15mL 2.5mM单宁酸，10mL 25mM硝酸银，90℃，保持30分钟；重复移出加入操作步骤，监测每次移出液的紫外吸收光谱，直到获得最大吸收峰为450nm的银纳米粒子溶液。
[0013]取五份100mL银纳米粒子溶液（粒子数约为10
11
个/mL），6500转离心15分钟，弃上清；沉淀分别重悬于100mL含抗AFB1、抗OTA、抗ZEN、抗DON和抗FB1的鼠单抗腹水的0.1M pH7.5的硼酸缓冲液；室温缓慢搅拌2h，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀重悬于100mL含0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的硼酸缓冲液（储存液）中，5分钟后，6500转离心15分钟，沉淀重悬于10mL储存液中，4℃保存备用。
[0014]考虑到国家标准中对伏马菌素B1、B2和B3的总量限量，本专利技术选择与FB2、FB3交叉反应率大于70%的抗FB1的鼠单抗，由此制备的银内滤探针可以同时有效地捕获FB1、FB2和FB3，以满足国家标准对三种伏马菌素总量的限量要求。
[0015]（2）CdSe/ZnS量子点与BSA偶联。
[0016]五种色彩CdSe/ZnS量子点（QD），分别为蓝色（QD
500
）、绿色（QD
530
）、黄色（QD
570
）、橙色（QD
600
）和红色（QD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征是包括如下步骤：（1）银内滤探针制备：在1000mL体系中调整柠檬酸钠浓度至5mM，单宁酸0.025mM，剧烈搅拌下加热至沸腾，加入10mL 25mM硝酸银，溶液变成亮黄色；移出200mL反应液，反应体系中再加入170mL水，温度设定90℃，加入5mL 25 mM柠檬酸钠，15mL 2.5mM单宁酸，10mL 25mM硝酸银，90℃，保持30分钟；重复移出加入操作步骤，监测每次移出液的紫外吸收光谱，直到获得最大吸收峰为450nm的银纳米粒子溶液；取五份100mL粒子数约为10
11
个/mL的银纳米粒子溶液，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀分别重悬于100mL含抗AFB1、抗OTA、抗ZEN、抗DON和抗FB1的鼠单抗腹水的0.1M pH7.5的硼酸缓冲液；室温缓慢搅拌2h，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀重悬于100mL含0.1%（w/v）牛血清白蛋白的硼酸缓冲液中，5分钟后，6500转离心15分钟，沉淀重悬于10mL储存液中，4℃保存备用；CdSe/ZnS量子点与BSA偶联：五种色彩CdSe/ZnS量子点（QD），分别为蓝色QD
500
、绿色QD
530
、黄色QD
570
、橙色QD
600
和红色QD
630
，表面羧基化处理，经EDC活化后与BSA偶联；五种羧基化量子点调整浓度为1
µ
M，分别取1mL，调整pH 至5.7，室温低速搅拌下，加入0.1mL新鲜配制的1mg/mL EDC水溶液，活化5分钟，随后加入0.1mL 1% BSA溶液，室温反应1h；再加入0.12mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.12mL 1% BSA溶液，室温反应1h；第三次加入0.15mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.15mL 1% BSA溶液，室温反应2h；1000转离心5分钟去除过度聚合物，4℃储存待用；（3）免疫层析试纸条的组装：免疫层析试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸五部分交叠固定在粘性卡纸上；最底层为粘性卡纸，其中间部位粘贴NC膜，NC膜预先在检测区喷涂五种检测抗原和五色BSA
–
QD混合物，在质控位置喷涂驴抗鼠IgG抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：江湖，熊勇华，赖卫华，郭亮，李响敏，聂丽娟，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：