TLR9基因人源化的动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种TLR9基因人源化的动物模型、其构建方法及应用，具体涉及表达人或人源化TLR9蛋白的人源化TLR9基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。本发明专利技术还涉及一种人源化TLR9蛋白、人源化TLR9基因以及构建TLR9基因人源化的动物模型的靶向载体。TLR9基因人源化的动物模型的靶向载体。TLR9基因人源化的动物模型的靶向载体。

【技术实现步骤摘要】
TLR9基因人源化的动物模型的构建方法及应用


[0001]本申请涉及基因人源化改造动物模型的建立方法及应用
，具体而言，涉及基于一种编码人源化TLR9蛋白的基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

技术介绍

[0002]天然免疫在微生物感染早期具有重要作用，参与天然免疫应答的细胞通过识别病原微生物中具有保守序列的结构后，迅速启动天然免疫应答。作为识别病原体并快速启动反应的蛋白，Toll样受体家族在对抗外来病原微生物的天然免疫中发挥了重要作用。其中Toll样受体9(TLR9)为I型跨膜蛋白，分为信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四部分，胞外区由25个富含亮氨酸的重复序列(LRR)组成，是哺乳动物细胞识别病毒和细菌基因组中的非甲基化胞嘧啶
‑
磷酸
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鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG)的主要受体。已有研究发现TLR9不仅表达在固有免疫系统中(包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞等免疫细胞)，还表达在人的气管黏膜上皮、消化道、胰腺等组织，以及多种实体瘤和血液瘤细胞上。
[0003]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N，Snaith M，Wolf Ct，Seibler J.Generation and utility of genetically humanized mouse models，Drug Discov Today；18(23
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24)：1200
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11，2013)。
[0004]已有研究表明TLR9信号通路在感染性疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤防控应用等方面发挥重要作用。但不同种属中TLR9识别的配体不同，因此不能用普通小鼠进行抗人TLR9靶向药物的筛选。考虑TLR9在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效，本专利技术在提供一种建立人源化TLR9基因改造动物模型的新方法，得到的TLR9基因人源化动物可作为新药研发和临床前研究的工具，用于药物筛选等用途。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面，提供了一种TLR9基因人源化的动物模型的构建方法，所述的动物模型体内表达人或人源化TLR9蛋白，所述的动物模型内源TLR9蛋白表达降低或缺失。
[0006]优选的，所述的人源化TLR9蛋白包含人TLR9蛋白的胞外区，进一步优选包含下列
组中的一种：
[0007]A)SEQ ID NO：4第26
‑
818位所示氨基酸序列；
[0008]B)与SEQ ID NO：4第26
‑
818位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0009]C)与SEQ ID NO：4第26
‑
818位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
[0010]D)与SEQ ID NO：4第26
‑
818位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0011]优选的，所述的人源化TLR9蛋白还包含动物模型内源TLR9蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞内区。进一步优选的，所述的人源化TLR9蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
[0012]a)SEQ ID No：12所示氨基酸序列；
[0013]b)与SEQ ID NO：12所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0014]c)与SEQ ID NO：12所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
[0015]d)与SEQ ID NO：12所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0016]优选的，所述的动物模型的基因组中包含人TLR9基因的2号外显子的部分序列。进一步优选包含编码人TLR9胞外区的2号外显子核苷酸序列。更进一步优选包含下列组中的一种：
[0017](A)SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；
[0018](B)与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0019](C)与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
[0020](D)具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
[0021]优选的，所述的动物模型的基因组中包含人源化TLR9基因，所述的人源化TLR9基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
[0022](a)SEQ ID NO：11所示核苷酸序列；
[0023](b)与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0024](c)与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0025](d)具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0026](e)包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
[0027](f)与包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0028](g)与包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TLR9基因人源化的动物模型的构建方法，其特征在于，所述的动物模型体内表达人或人源化TLR9蛋白，且所述的动物模型内源TLR9蛋白表达降低或缺失。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化TLR9蛋白包含人TLR9蛋白的胞外区，优选包含下列组中的一种：A)SEQ ID NO：4第26
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818位所示氨基酸序列；B)与SEQ ID NO：4第26
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818位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：4第26
‑
818位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，D)与SEQ ID NO：4第26
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818位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，任选地，所述的人源化TLR9蛋白还包含动物模型内源TLR9蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞内区；优选的，所述的人源化TLR9蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：a)SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：12所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与SEQIDNO：12所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，d)与SEQ ID NO：12所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的动物模型的基因组中包含人TLR9基因的2号外显子的部分序列，优选包含编码人TLR9胞外区的2号外显子核苷酸序列，进一步优选包含下列组中的一种：(A)SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；(B)与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(C)与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，(D)具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。4.根据权利要求1
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3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的动物模型的基因组中包含人源化TLR9基因，所述的人源化TLR9基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：(a)SEQ ID NO：11所示核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(c)与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；(d)具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
(e)包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；(f)与包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(g)与包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，(h)具有包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。5.根据权利要求1
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4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将人TLR9基因的2号外显子部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物TLR9基因座上；优选包括将编码人TLR9蛋白胞外区的核苷酸序列可操作的连接在非人动物TLR9基因座上，任选地，使用靶向载体进行动物模型的构建，所述的靶向载体包含人TLR9的2号外显子部分核苷酸序列，优选包含编码胞外区的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：7；优选的，所述的靶向载体还包含5
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臂和/或3
’
臂，所述的5
’
臂或3
’
臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选自TLR9基因基因组DNA的100
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10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5
’
臂如SEQ ID NO：5所示，所述的3
’
臂序列如SEQ ID NO：6所示。6.一种人源化TLR9蛋白，其特征在于，所述的人源化TLR9蛋白包含人TLR9蛋白的胞外区，优选包含SEQ ID NO：4第26
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818位所示氨基酸序列。7.根据权利要求6所述的人源化TLR9蛋白，其特征在于，所述的人源化TLR9蛋白还包含非人动物TLR9蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞内区，优选包含SEQ ID NO：2第1
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25位和/或第820
‑
1032位；进一步优选的，所述的人源化TLR9蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：a)SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：12所示氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，姚佳维，郭朝设，张美玲，黄蕤，郭雅南，白阳，赵磊，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：