磷酸酶PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用制造技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及磷酸酶PHLPP2作为生物标志物中的用途，尤其涉及PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用。本发明专利技术所述磷酸酶其PH结构域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2，能使Akt、RAF1等的相应保守位点直接去磷酸化，从而促进细胞凋亡和抑制细胞增殖和迁移；经试验表明，降低PHLPP2的表达水平，可抑制维生素C对胰腺癌肿瘤的杀伤作用，PHLPP2的高表达与病人生存期呈正相关，与TNM分期呈负相关，所述PHLPP2可作为维生素C治疗胰腺癌的潜在生物标志物，进一步用于制备维生素C治疗胰腺癌的预后标志物制剂。素C治疗胰腺癌的预后标志物制剂。

【技术实现步骤摘要】
磷酸酶PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用


[0001]本专利技术生物
，涉及一种磷酸酶PHLPP2作为生物标志物中的用途，尤其涉及PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用。

技术介绍

[0002]据报道，胰腺癌是高度致命疾病，最新数据显示在美国每年约有56770例新发病例和45750例死亡。临床实践显示，由于诊断的滞后性和治疗的耐药性，胰腺癌患者的预后极差，5年生存率保持在6％。研究报道了维生素C在体内外均有杀伤肿瘤的效果，但是最近的胰腺癌临床试验研究和案例研究均未能明确维生素C的临床疗效或者仅仅阐述了维生素C能改善病人的生活质量和提高化疗的敏感性。这提示有关医疗实践中需要生物标志物来识别不同个体VC治疗的敏感性。PHLPP家族是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由PHLPP1和PHLLP2两个基因编码。PHLPP1主要有2个主要的剪切体，PHLPP1α(1205个氨基酸)和PHLPP1β(1717个氨基酸，也被称为suprachiasmatic nucleus oscillatory protein,SCOP)，PHLPP2由1323个氨基酸组成。研究显示，PHLPP1/2基因都位于癌症通常缺失的染色体区域，这与它们的肿瘤抑制效果是一致的。PHLPP已被证实能通过去磷酸化Akt使其失去活性,从而负向调节Akt。有研究发现在非小细胞肺癌细胞和乳腺癌细胞过表达PHLPP导致Akt活性降低,使得细胞凋亡增加。
[0003]另有研究发现PHLPP2在胰腺癌、慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤等许多肿瘤中呈现低表达,并且恶性胶质瘤患者的PHLLP表达越高,其存活率也越高；有体外研究表明，过表达PHLPP2可抑制前列腺癌、膀胱癌和子宫内膜癌的肿瘤生长。虽然多项研究表明PHLPP2能够抑制肿瘤发生、发展，但它是否在维生素C抑制胰腺癌的发生发展中发挥作用及作为维生素C治疗胰腺癌的潜在生物标志物尚未明确。
[0004]基于现有技术的基础与现状，本申请的专利技术人拟提供一种用于预测维生素C治疗胰腺癌疗效的潜在生物标志物，具体涉及PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于基于现有技术的基础与现状，针对维生素C治疗胰腺癌缺乏有效的生物标志物的现状，提供一种用于预测维生素C治疗胰腺癌疗效的潜在生物标志物，尤其涉及PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0007]一)细胞培养和试剂：
[0008]人胰腺癌癌细胞Capan-1和PANC-1购自中科院细胞库。细胞培养于DMEM+10％FBS。维生素C购自Sigma公司，溶于1
×
PBS中。
[0009]二)定量PCR检测PHLPP2 mRNA水平：
[0010]Trizol法提取细胞总RNA。利用购自翊圣公司的Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用购自翊圣公司的SYBR Green Mix试剂盒对cDNA进行PCR扩增。将β-actin作为内参，ΔΔCT法分析基因转录水平。
[0011]三)细胞CCK8检测：
[0012]胰腺癌细胞消化计数，10000个/孔铺于96孔板中，培养24小时后加入不同浓度的维生素C培养48小时后，根据CCK8(购自Dijindo)试剂盒说明书进行检测。
[0013]四)克隆形成：
[0014]胰腺癌细胞消化计数，1000个/孔铺于6孔板，培养24小时后加入0.5mM维生素C再培养48小时，继续培养7天后用4％多聚甲醛固定、0.01％结晶紫染色、计数克隆数。
[0015]五)划痕实验：
[0016]胰腺癌细胞消化计数，1x106/孔铺在6孔板中培养24小时，用200μL灭菌枪头划线后用PBS漂洗后加入4mM维生素C继续培养，按0和24小时取样拍照。
[0017]六)细胞凋亡检测：
[0018]胰腺癌细胞消化计数，1x106/孔铺在6孔板中,用4mM维生素C处理48小时后，用Annexin V(购自BD公司)染色30分钟，再用7-AAD(购自Invitrogen)染色5min；凋亡细胞的比例用BD Calibur进行流式检测；
[0019]七)PHLPP2对RAS/RAF信号通路的影响试验：采用western blot检测RAF1的磷酸化水平，其中:
[0020](1)用RIPA裂解液(购自碧云天)裂解细胞，用BCA试剂盒(购自碧云天)检测蛋白浓度后，将SDS-PAGE sample loading buffer(购自碧云天)加入蛋白样品中；
[0021](2)将蛋白样品用10％的SDS-PAGE(购自雅酶)分离后转至硝化纤维素滤膜(购自Millipore)；
[0022](3)将蛋白膜放置到5％脱脂牛奶中封闭1小时后用TBST将牛奶漂洗干净；
[0023](4)蛋白膜在4℃条件下与Phospho-c-Raf(Ser338)抗体(购自CST公司，1:1000)、C-raf抗体(购自CST公司，1:1000)、GAPDH抗体(购自CST公司，1:1000)孵育过夜，用TBST洗涤3次；
[0024](5)将膜与辣根过氧化物酶标记的兔二抗(购自CST公司，1:5000)在室温下孵育1小时，用TBST洗涤3次；
[0025](6)用ImageQuantLAS4000mini扫描仪(购自GE Healthcare公司)检测。用Image-J软件对图像进行分析。
[0026]本专利技术采用GraphPad Prism8统计软件分析资料；对计量资料，采用非配对T检验。采用Kaplan
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Meier法进行生存分析；以P<0.05认为存在统计学差异，以P<0.01认为存在明显统计学差异；以P<0.001认为存在高度统计学差异，统计均取双尾检验。
[0027]实验结果显示：维生素C能抑制胰腺癌细胞增殖，抑制胰腺癌细胞细胞迁移，促进胰腺癌细胞凋亡，下调PHLPP2可减弱维生素C对胃癌细胞迁移的抑制作用和减弱维生素C对胰腺癌细胞株迁移的抑制作用，下调PHLPP2可抑制维生素C对促胰腺癌细胞凋亡作用，实验结果还显示，PHLPP2对RAS/RAF信号通路有影响，表明维生素C的抑癌作用与通过PHLPP2抑制Raf1磷酸化有关；本专利技术进一步分析了胰腺癌病人PHLPP2表达和预后的关系，结果显示，PHLPP2高表达与TNM分期呈负相关(P＝0.0143)。
[0028]本专利技术提供了PHLPP2可作为预测维生素C治疗胰腺癌疗效的潜在生物标志物，进一步，该PHLPP2可用于制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的应用。
附图说明
[0029]图1显示了维生素C能抑制胰腺癌细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.磷酸酶PHLPP2在制备评估维生素C治疗胰腺癌疗效的生物标志物中的用途。2.磷酸酶PHLPP2在制备维生素C治疗胰腺癌预后标志物制剂中的用途。3.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，下调PHLPP2能减弱维生素C对胰腺癌细胞株迁移的抑制作用。4.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，下调PHLPP2能抑制维生素C对...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，骆菲菲，陈琳，宋欢，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：