一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法，特点是包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，其用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）样品DNA提取；（2）根据火鸡16S rRNA、鹅16S rRNA、猪细胞色素

【技术实现步骤摘要】
一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法
本专利技术属于食品质量安全检测
，尤其是涉及一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法。
技术介绍
随着社会经济发展，人们的生活消费水平不断提高，肉类及其制品成为人们日常食物的重要来源和组成部分。然而，多源化的肉制品促使人们餐桌文化日趋丰富的同时，也给肉类掺假者带来了可乘之机。部分不法企业及商贩，为了追求自身利益以次充好，在高成本的羊肉、牛肉等高价商业肉中掺入其他的低廉肉或异种肉进行售卖。这可能对患有传染病、代谢紊乱或过敏的人带来潜在的健康风险。同时也可能侵犯部分消费者的宗教信仰，例如包含猪肉成分的食品不被一些宗教信仰者所接受。因此，肉制品掺假不仅仅涉及消费者的经济、营养价值和食品安全等问题，而且扰乱了肉类流通市场秩序。近年来，鉴别肉类品种的技术不断发展。感官分析、解剖和组织学差异、免疫血清扩散、色谱和DNA杂交等技术已经发展起来。其中，基于蛋白质水平的分析方法被广泛用于复合混合肉类品种的鉴定。然而，在加工过程中，蛋白质可能会变性、被降解或损坏，影响热处理食品中肉类种类鉴定的准确性。相比之下，基于DNA的分析方法结合聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)在肉类品种的鉴别和错标记检测中，是一种可靠的替代方法，因为DNA分子具有高稳定性，且广泛存在于各种类型的细胞中。线粒体DNA具有较高的拷贝数和较强的稳定性，确保了其在生肉和熟肉产品中的检测下限和可用性，作为靶标并被广泛应用于PCR检测分析。例如，细胞色素b基因、D-loop基因、12S和16SrRNA基因、ATPase亚基8和6基因、NADH脱氢酶基因等是识别肉类物种的有效靶标。已有研究发现为线粒体DNA序列在物种鉴定中的作用提供了可靠的证据。因此，基于线粒体DNA序列，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场上肉制品安全的基础和关键之一。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高和特异性好的用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组，包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，所述的火鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT-3’，反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC-3’；鹅特异性引物对的序列为：正向引物：5’-TTAGACGCGATAGAGACCCCA-3’，反向引物：5’-GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG-3’；猪特异性引物对的序列为：正向引物：5’-CAGCCCGGAACCCTACTTG-3’，反向引物：5’-GTTCATCCAGTACCCGCTCC-3’；羊特异性引物对的序列为：正向引物：5’-AGATATCGGCACCCTTTACCTTC-3’，反向引物：5’-CTGCTCCGGCCTCAACCAT-3’；牛特异性引物对的序列为：正向引物：5’-GTGCCTGATAATACTCTGACCAC-3’，反向引物：5’-CACCCCAACCGAAACTACCAA-3’；鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5’-TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC-3’，反向引物：5’-AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA-3’；鸭特异性引物对的序列为：正向引物：5’-TGCCCTCAATAGCCTTCACC-3’，反向引物：5’-CATACTTCTTTCCGTGTTGCC-3’。2、一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）样品DNA提取根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取；（2）多重PCR引物设计根据火鸡16SrRNA、鹅16SrRNA、猪细胞色素c氧化酶亚基I、绵羊细胞色素c氧化酶亚基I、黄牛16SrRNA、鸡细胞色素c氧化酶亚基I和鸭12SrRNA基因序列分别设计物种特异性引物；（3）多重PCR反应条件25µL多重PCR反应体系：10×EasyTaq®反应缓冲液2.5μL，2.5mMdNTPs2µL，Taq酶0.6µL，混合物种上下游引物均0.5μL，基因组DNA0.01-10ng，用无菌水补足体系；PCR反应程序为94℃5min；94℃30s、63℃30s、72℃45s共计34个循环；最后72℃延伸5min；（4）结果分析PCR扩增反应结束后，将10μL扩增产物与1μL10×上样缓冲液混合，用4wt%琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断是否掺杂以及掺杂的肉类。所述的混合物种上下游引物包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，所述的火鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT-3’，反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC-3’；鹅特异性引物对的序列为：正向引物：5’-TTAGACGCGATAGAGACCCCA-3’，反向引物：5’-GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG-3’；猪特异性引物对的序列为：正向引物：5’-CAGCCCGGAACCCTACTTG-3’，反向引物：5’-GTTCATCCAGTACCCGCTCC-3’；羊特异性引物对的序列为：正向引物：5’-AGATATCGGCACCCTTTACCTTC-3’，反向引物：5’-CTGCTCCGGCCTCAACCAT-3’；牛特异性引物对的序列为：正向引物：5’-GTGCCTGATAATACTCTGACCAC-3’，反向引物：5’-CACCCCAACCGAAACTACCAA-3’；鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5’-TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC-3’，反向引物：5’-AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA-3’；鸭特异性引物对的序列为：正向引物：5’-TGCCCTCAATAGCCTTCACC-3’，反向引物：5’-CATACTTCTTTCCGTGTTGCC-3’。与现有技术相比，本专利技术的优点在于1、本专利技术利用多重多聚酶链反应依据片段大小可以在一次PCR中检测出七种肉类。2、本专利技术中设计的引物对每一个特定物种都具有很高的特异性，至少与15种动物没有交叉反应。3、本专利技术中检测方法灵敏度高，可以对每一种反应检测到低至0.01ng的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组，其特征在于包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，/n所述的火鸡特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’，/n反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’；/n鹅特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’，/n反向引物：5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’；/n猪特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’，/n反向引物：5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’；/n羊特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’，/n反向引物：5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’；/n牛特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’，/n反向引物：5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’；/n鸡特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’，/n反向引物：5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’；/n鸭特异性引物对的序列为：/n正向引物：5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’，/n反向引物：5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组，其特征在于包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，
所述的火鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT-3’，
反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC-3’；
鹅特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-TTAGACGCGATAGAGACCCCA-3’，
反向引物：5’-GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG-3’；
猪特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-CAGCCCGGAACCCTACTTG-3’，
反向引物：5’-GTTCATCCAGTACCCGCTCC-3’；
羊特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-AGATATCGGCACCCTTTACCTTC-3’，
反向引物：5’-CTGCTCCGGCCTCAACCAT-3’；
牛特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-GTGCCTGATAATACTCTGACCAC-3’，
反向引物：5’-CACCCCAACCGAAACTACCAA-3’；
鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC-3’，
反向引物：5’-AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA-3’；
鸭特异性引物对的序列为：
正向引物：5’-TGCCCTCAATAGCCTTCACC-3’，
反向引物：5’-CATACTTCTTTCCGTGTTGCC-3’。


2.一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）样品DNA提取
根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取；
（2）多重PCR引物设计
根据火鸡16SrRNA、鹅16SrRNA、猪细胞色素c氧化酶亚基I、绵羊细胞色素c氧化酶亚基I、黄牛16SrRNA、鸡细胞色素c氧化酶亚基I和鸭12SrRNA基因序列分别设计物种特异性引物；
（3）多重PCR反应条件
25µL多重PCR反应体系：10×EasyTaq®反...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡振东，潘道东，马慧，周松，曹锦轩，袁馨怡，曾小群，吴振，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33