一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30及应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30及应用。通过将本申请的菌株用于解有机磷的试验中，发现此菌株可以从植酸钙中活化出的速效磷含量为4.44mg/L，对植酸钙的活化率达到76.74％。可见褐球固氮菌不仅可以发挥生物固氮的作用，还能用于降解有机磷，并且降解效果很好。

【技术实现步骤摘要】
一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30及应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30及应用。
技术介绍
褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)，为假单胞菌目、假单胞菌科、褐球固氮菌属。特征为：细胞较大，为球杆状或杆状，菌体大小为2.0～3.0×3.0～6.0μm，常成对或八叠状排列；菌体有荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阴性。在无氮培养基上生长良好，菌苔粘稠、糊状，幼培养菌苔透明转乳白色，培养常呈褐色。常用于(1)生物固氮；(2)作为菌肥(多为联合固氮)，提高农作物产量，改善作物品质，提高作物抗逆性，降低对化学肥料的依赖性；(3)固氮酶活性测定方面。到目前为止还未见报道将褐球固氮菌用于降解有机磷方面的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30及应用，不仅丰富了微生物降解有机磷的菌种，还发现了褐球固氮菌的新用途。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30，所述褐球固氮菌的拉丁文为Azotobacterchroococcum，16SrDNA的序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30在降解有机磷方面的应用。作为优选，所述有机磷为植酸钙。本专利技术还提供了一种利用所述的狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30降解有机磷的方法，包括如下步骤：(1)将褐球固氮菌PP30进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；(2)将得到的扩大培养的解有机磷的菌株进行处理，制成解有机磷的菌液；(3)将解有机磷的菌液接种于有机磷液体培养基中进行培养，降解有机磷。作为优选，步骤(1)中扩大培养的培养基为LB培养基。作为优选，步骤(1)中扩大培养的条件为：培养温度为35～39℃，培养转速为160～200r/min，培养时间为18～22h。作为优选，步骤(2)中所述解有机磷的菌液的OD值为0.5～0.7。作为优选，步骤(2)中制成解有机磷菌液的溶剂为质量分数为0.8～0.9％的NaCl溶液。作为优选，步骤(3)中的培养条件为：培养温度为35～39℃，培养转速为160～200r/min，培养时间为10～14h。本专利技术提供的菌株不仅具有生物固氮的功能，还可以从植酸钙中活化出速效磷，并且活化率高，说明此褐球固氮菌还具有降解有机磷的作用。不仅丰富了微生物降解有机磷的菌种类型，还为褐球固氮菌提供了新用途。附图说明图1为褐球固氮菌PP30在有机磷培养基上形成的溶磷圈。具体实施方式本专利技术提供了一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30，所述褐球固氮菌的拉丁文为Azotobacterchroococcum，16SrDNA的序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术中，所述狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30，采自甘肃省农业技术推广总站的野生牡丹-狭叶牡丹根际土壤中。在本专利技术中，所述狭叶牡丹根际土壤的采集方法为：先将土壤表层可见的杂物去除，根据五点采样法，在距离植株8～12cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，置于冰盒内保存。到达实验室后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下来，收集后混匀，放于4℃冰箱中冷藏保存、备用。在本专利技术中，所述狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30的分离步骤包括如下步骤：(1)称取采集得到的狭叶牡丹根际土壤，放入无菌离心管中，用无菌水定容后，混匀，得到混合均匀的根际土壤溶液；(2)将混合均匀的根际土壤溶液依次进行梯度稀释，得到稀释的根际土壤溶液；(3)将稀释的根际土壤溶液均匀涂布于有机磷固体培养基上，培养，得到狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30。在本专利技术中，所述狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30的分离步骤在超净工作台中进行的。在本专利技术中，所述离心管中放入的狭叶牡丹根际土壤的质量为4～6g，优选为5g。在本专利技术中，所述无菌水定容的体积为40～60mL，优选为50mL。在本专利技术中，所述混匀为振荡器混匀。在本专利技术中，所述混匀的时间为15～25min，优选为20min。在本专利技术中，所述根际土壤溶液依次进行梯度稀释的梯度为10倍梯度。在本专利技术中，所述涂布的稀释根际土壤溶液的稀释度为10-6-10-4。在本专利技术中，所述涂布的稀释根际土壤溶液的体积为100μl。在本专利技术中，所述有机磷固体培养基为改良的国际植物研究所磷酸盐生长培养基为NBRIP。在本专利技术中，所述NBRIP培养基中的磷酸三钙替换为植酸钙。在本专利技术中，所述植酸钙的用量为2g/L。在本专利技术中，所述培养温度为26～30℃，优选为28℃。在本专利技术中，所述培养为倒置培养。在本专利技术中，所述纯化方式为Z字形划线纯化。在本专利技术中，所述纯化得到的菌株保存在2～6℃的冰箱中，优选为4℃。在本专利技术中，所述纯化步骤在超净工作台中进行。在本专利技术中，所述狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30的鉴定包括如下步骤：(1)提取分离纯化菌株的基因组DNA，得到基因组DNA；(2)将基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；(3)将PCR产物进行纯化，得到纯化的PCR产物；(4)通过对纯化的PCR产物进行测序，分析鉴定得到的狭叶牡丹根际菌株PP30为褐球固氮菌。在本专利技术中，所述提取菌株基因组DNA的方式为：利用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒进行提取。在本专利技术中，所述PCR扩增的引物为：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’在本专利技术中，所述将PCR产物进行纯化是采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化。在本专利技术中，所述对纯化的PCR产物进行测序，是在上海派森诺生物科技股份有限公司的ABI3730-XL测序仪上进行双向测序。在本专利技术中，所述对菌株的分析鉴定步骤为：用ChromasPro软件截去测序后的无效序列，利用BioEdit软件对双端有效序列进行拼接，然后将有效序列在NCBI数据库中利用Blast程序，与NCBI数据库中的参考序列进行比对，获得与待测菌株序列相似性最大的菌株信息，即为鉴定结果。本专利技术还提供了狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30在降解有机磷方面的应用。在本专利技术中，所述有机磷为植酸钙。在本专利技术中，所述菌株解磷能力的定性检测方法为溶磷圈测定法。在本专利技术中，所述溶磷圈测定法为：将纯化得到的菌株点接于有机磷固体培养基中，培养，测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，并计算两者的比值。本专利技术还提供了一种利用所述的狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30降解有机磷的方法，包括如下步骤：(1)将褐球固氮菌PP30进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷菌株；(2)将得到的扩大培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30，其特征在于，所述褐球固氮菌的拉丁文为Azotobacter chroococcum，16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一株狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30，其特征在于，所述褐球固氮菌的拉丁文为Azotobacterchroococcum，16SrDNA的序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30在解有机磷方面的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述有机磷为植酸钙。


4.一种利用权利要求1所述的狭叶牡丹根际褐球固氮菌PP30解有机磷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将褐球固氮菌PP30进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；
(2)将得到的扩大培养的解有机磷的菌株进行处理，制成解有机磷的菌液；
(3)将解有机磷的菌液接种于有机磷液体培养基中进行培养，降解有机磷。

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【专利技术属性】
技术研发人员：郭丽丽，侯小改，王菲，宋程威，范丙友，罗亚桑，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41