一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用，荧光碳点以4‑（1‑哌啶基）苯胺为原料，无水乙醇为溶剂，在高压反应釜中160℃反应12 h，反应后的粗产品用硅胶柱层析法进行纯化，以不同比例的石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂，经旋转蒸发和进一步干燥，得到纯化的荧光碳点。该碳点能在10 s内迅速透过细胞膜并聚集在脂滴中，可用于活细胞中超快免洗的脂滴成像以及双酚A引起的非酒精性脂肪肝变化。本发明专利技术荧光碳点的合成和纯化十分简单，并具有光稳定好、斯托克斯位移大、信噪比高等优点，能快速进入细胞，并能够天然靶向脂滴。

【技术实现步骤摘要】
一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用
本专利技术涉及荧光纳米材料制造领域，具体涉及一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用。
技术介绍
脂滴是由各种中性脂质（如甘油三脂和胆固醇酯）组成的疏水核心和磷脂单分子层构成的动态球形细胞器，它在各种生理过程发挥着不可或缺的作用，如：脂质代谢与存储，信号传导，细胞凋亡，蛋白质降解等。一旦脂滴异常积累就会导致罹患脂肪肝、肥胖、糖尿病，甚至癌症的风险。因此，对脂滴进行成像是非常必要的，这对于研究脂滴在正常或生理和病理条件下的功能非常有意义，也为脂滴相关疾病的早期临床诊断提供了有用的信息。然而，目前几乎只有小分子荧光探针用于脂滴成像，如最常用的商业化脂滴荧光探针BODIPY493/503和NileRed，但它们存在一些固有的缺点，如BODIPY493/503的斯托克斯位移小、容易造成荧光串色，而NileRed对脂滴的特异性性差导致成像信噪比低。另外其他的脂滴荧光探针也同样面临着合成过程繁琐，纯化过程复杂等困难，这严重阻碍了对脂滴生物应用的深入研究。因此，发展一种简便的方法制备脂滴靶向探针是很重要的。碳点，作为新型的荧光纳米材料，因具有合成纯化过程简单、原料便宜易得、光稳定性和生物相容性良好等优点，而被广泛应用于传感识别和生物成像领域。目前，碳点已经实现了对多种细胞器的靶向，如溶酶体、线粒体、内质网和细胞核等。然而，基于碳点的脂滴特异性探针的报道少之又少，这极大地限制了碳点在生物成像领域的深入研究。因此，合成一种能靶向脂滴的碳点是十分必要的，这有利于拓宽碳点的应用范围并提高碳点的竞争力。r>
技术实现思路
本专利技术提出了一种脂滴靶向的脂溶性碳点的制备方法及应用，以4-（1-哌啶基）苯胺反应生成的脂溶性碳点，能在10s内迅速透过细胞膜并聚集在脂滴中，可用于活细胞中超快速和免洗的脂滴成像以及可视化双酚A引起的非酒精性脂肪肝变化。该方法操作简单、原料易得、绿色环保。实现本专利技术的技术方案是：一种脂滴靶向的脂溶性碳点的制备方法，所述荧光碳点以4-（1-哌啶基）苯胺为原料，无水乙醇为溶剂，在高压反应釜中160℃反应12h，反应后的粗产品用硅胶柱层析法进行纯化，以不同比例的石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂，经旋转蒸发和进一步干燥，得到纯化的荧光碳点。该碳点能在10s内迅速透过细胞膜并聚集在脂滴中，可用于活细胞中超快免洗的脂滴成像以及双酚A引起的非酒精性脂肪肝变化。具体步骤如下：（1）将4-（1-哌啶基）苯胺溶于无水乙醇中，其混合溶液置于高压反应釜中；（2）将步骤（1）中的高压反应釜放入烘箱，将混合溶液加热至160反应2h，反应后的产品自然冷却至室温，得到红棕色溶液；（3）将步骤（2）的粗产品用硅胶柱层析法进行纯化，以不同比例的石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂；（4）将步骤（3）得到碳点溶液进行旋转蒸发和进一步干燥，得到纯化的荧光碳点。合成路线为：。所述4-（1-哌啶基）苯胺溶于无水乙醇的浓度为10mg/mL。本专利技术制备的碳点是用于脂滴靶向的脂溶性碳点以及可视化双酚A引起的非酒精性脂肪肝变化。上述应用具体包括：分别观察碳点储备液（及碳点溶于无水乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂中）在不同溶剂中荧光强度变化，荧光碳点的激发波长为525nm。观察碳点孵育的细胞荧光成像图的变化。观察碳点孵育在双酚A处理的细胞荧光成像图的变化。荧光光谱的变化为：以525nm光激发时，在不同溶剂中加入碳点储备液，在水溶液中的以荧光最低，几乎可以忽略不计，可用于免洗成像。荧光成像图的变化：用碳点孵育细胞，并用共聚焦显微镜，以激发波长为496nm光源激发，进行共聚焦成像；用碳点孵育双酚A处理的细胞，并用共聚焦显微镜，以激发波长为496nm光源激发，进行共聚焦成像。具体步骤如下：（1）称取荧光碳点固体，用溶剂溶解，配置5mg/mL的碳点储备液；（2）将10μg/mL碳点储备液与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察碳点进入活细胞的时间；（3）将10μg/mL碳点储备液与细胞共同孵育1min，通过共聚焦显微镜观察无洗涤成像和洗涤后成像的区别；（4）将脂滴商染BODIPY493/503与细胞共同避光孵育20min，然后加入碳点储备液，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；（5）将10μg/mL碳点储备液与用双酚A处理的细胞共同孵育1min，通过共聚焦显微镜观察脂滴变化。进一步的，上述应用，具体的，包括以下步骤：（1）称取碳点，用无水乙醇或其他有机溶剂溶解，准确配置5mg/mL的碳点储备液；（2）向比色皿中加入2mL的不同溶剂，加入4μL的碳点储备液，观察荧光图谱的变化；溶剂分别为甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、乙醇、甲醇或水；（3）向比色皿中加入2mL的不同含水量（0-100%）的1,4-二氧六环溶液，再加入4μL的碳点储备液，观察荧光图谱的变化；（4）将10μg/mL碳点储备液与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察碳点进入活细胞的时间；（5）将10μg/mL碳点储备液与细胞共同孵育1min，通过共聚焦显微镜观察无洗涤成像和洗涤后成像的区别；（6）将脂滴商染BODIPY493/503与细胞共同避光孵育20min，然后加入10μg/mL碳点储备液，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；（7）将10μg/mL碳点储备液与用双酚A处理的细胞共同孵育1min，通过共聚焦显微镜观察脂滴变化。所述步骤（7）中双酚A的浓度为20μM，处理细胞时间为0、12、24、36、48h。本专利技术的有益效果是：（1）荧光碳点的合成和纯化十分简单，并具有光稳定好、斯托克斯位移大、信噪比高等优点；（2）本专利技术能在10s内快速进入细胞，并能够天然靶向脂滴；（3）本专利技术可在活细胞中进行超快速和免洗脂滴成像；（4）本专利技术可以可视化双酚A引起的非酒精性脂肪肝变化。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是在525nm激发下，10μg/mL碳点在不同溶剂中的荧光发射光谱图。图2是在525nm激发下，10μg/mL碳点在不同含水量（0-100%）的1,4-二氧六环溶液中荧光发射光谱图。图3是10μg/mL三种不同的碳点在细胞中的细胞器定位情况，激发波长是420nm，收集波段570-650nm。激发波长是510nm，收集波段580-670nm。激发波长是496nm，收集波段550-600nm。图4是10μg/mL碳点进入细胞的时间和荧光强度随时间变化的曲线图，激发波长是496nm，收集波段550-600nm。图5是无PBS洗涤和用PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂滴靶向的脂溶性碳点的制备方法，其特征在于，步骤如下：以4-（1-哌啶基）苯胺为原料，无水乙醇为溶剂，在高压反应釜中反应，反应后的粗产品用硅胶柱层析法进行纯化、洗脱、旋转蒸发和干燥，得到纯化的荧光碳点。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂滴靶向的脂溶性碳点的制备方法，其特征在于，步骤如下：以4-（1-哌啶基）苯胺为原料，无水乙醇为溶剂，在高压反应釜中反应，反应后的粗产品用硅胶柱层析法进行纯化、洗脱、旋转蒸发和干燥，得到纯化的荧光碳点。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述4-（1-哌啶基）苯胺溶于无水乙醇的浓度为10mg/mL。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述高压反应釜反应温度为160℃，反应12h。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：洗脱剂采用石油醚和乙酸乙酯。


5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将4-（1-哌啶基）苯胺溶于无水乙醇中，其混合溶液置于高压反应釜中；
（2）将步骤（1）中的高压反应釜放入烘箱，将混合溶液加热至160℃反应2h，反应后的产品自然冷却至室温，得到红棕色溶液；
（3）将步骤（2）的粗产品用硅胶柱层析法进行纯化，以不同比例的石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂；
（4）将步骤（3）得到碳点溶液进行旋转蒸发和进一步干燥，得到纯化的荧光碳点。


6.权利要求5所述的制备方法制备的荧光碳点，其特征在于：所述荧光碳点为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝辉，王军丽，孙远强，杨冉，屈凌波，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41