提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株技术

本申请公开了一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株。通过外源质粒的启动子使用Tet‑on系统，利用同源重组在黑曲霉糖化酶高产的尿嘧啶缺陷型(pyrG‑)菌株上进行整合，使得酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种过表达，通过脂肪酸代谢途径的调控大大提高了黑曲霉的糖化酶生产能力。

【技术实现步骤摘要】
提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株
本申请涉及生物工程
，具体涉及一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株。
技术介绍
葡萄糖水解酶(Glucoamylase,E.C.3.2.1.3.)也被称为糖化酶(amyloglucosidase),是一种一条肽链的酸性糖蛋白酶，具有外切活力，能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物碳链上的1,4糖苷键连接的非还原端，终产物是β-D-葡萄糖，也可水解α-1,6和α-1,3糖苷键，只是相对水解速度较慢。葡萄糖淀粉酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，自上世纪70年代黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶被首次纯化出来后，它便被广泛地应用于淀粉糖、食品、医药、酿造等工业生产中，是世界上仅次于蛋白酶的第二大类酶制剂，占全球酶制剂交易市场的25-33％。目前，工业上糖化酶的生产主要是由Aspergillus和Rhizopu属发酵制取。构建糖化酶基因的高拷贝工程菌，异源表达以及糖化酶发酵培养基和工艺的优化，如优化培养温度，pH，菌丝体大小，通气，搅拌以及反应器的类型，是提高糖化酶工业化生产的主要手段，寻找新的糖化酶或通过蛋白工程改造提高现有糖化酶的催化效率是近年来主要的研究方向。黑曲霉(Aspergillus)是一种常见的丝状真菌，因其强大的蛋白质分泌能力和良好的安全性被广泛用于多种酶制剂的生产。随着基因组学技术的日益发展和成熟，黑曲霉的基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等组学数据不断增长。黑曲霉作为生产工业用酶的重要生产菌株，深入研究其高效产酶机制和分泌机制具有重要的现实意义。目前，转录组学分析广泛地应用于分析不同环境变量，不同产酶水平菌株之间产酶量差异的关键因素，寻找起到关键调控作用的基因或基因簇，为后续的菌种改造提高黑曲霉产酶性能提供潜在的靶点。黑曲霉的研究主要从蛋白分泌途径改造、菌丝形态、增强产酸能力、代谢调控等方面开展，但是极少的研究从脂肪酸代谢的角度对黑曲霉细胞工厂进行优化。
技术实现思路
本申请提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株，通过黑曲霉中脂肪酸代谢调控基因的过表达可有效提高黑曲霉的糖化酶生产能力。本申请提供如下技术方案：第一方面，本申请提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，包括：在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。在一些实施方案中，所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种。在一些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶编码基因为An14g03240基因(GENEID:4987180)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因为An04g05720基因(GENEID:4990979)；所述细胞色素P450单加氧酶编码基因为An03g06460基因(GENEID:4980633)。在一些实施方案中，所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件。在一些实施方案中，所述方法包括：将所述脂肪酸代谢途径调控基因插入到含有可诱导表达Tet-on系统的质粒中，并导入黑曲霉菌株，使所述脂肪酸代谢途径调控基因在所述黑曲霉菌株中过表达。第二方面，本申请进一步提供一种糖化酶生产能力提高的重组黑曲霉菌株，所述重组黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。在一些实施方案中，所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种。在一些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶编码基因为An14g03240基因(GENEID:4987180)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因为An04g05720基因(GENEID:4990979)；所述细胞色素P450单加氧酶编码基因为An03g06460基因(GENEID:4980633)。在一些实施方案中，所述重组黑曲霉菌株包括调控所述脂肪酸代谢途径调控基因过表达的基因表达调控元件，例如所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件。在一些实施方案中，所述重组黑曲霉菌株为尿嘧啶缺陷型。第三方面，本申请还提供上述重组黑曲霉菌株在制备糖化酶中的应用。在一些实施方案中，所述应用包括：发酵培养所述重组黑曲霉菌株，使其表达糖化酶。本申请的专利技术人从转录组响应水平进行分析发现，氧限制期发酵过程中菌体蛋白合成减弱，而脂类分解代谢上调，糖化酶及其原料氨基酸的合成上调，进而提出脂肪酸的分解代谢能够提供乙酰辅酶A等重要前体和能量并流向糖化酶合成，通过结合转录组数据(氧限制期转录水平显著上调)、KEGG数据库(脂肪酸降解途径)以及黑曲霉数据库的基因功能宏观预测来筛选可显著改善黑曲霉糖化酶生产能力的目的基因，并通过一步克隆构建整合外源质粒载体与目的基因，并且外源质粒的启动子使用Tet-on系统，利用同源重组在黑曲霉糖化酶高产的尿嘧啶缺陷型(pyrG-)菌株上进行整合，大大提高了重组菌株的糖化酶生产能力。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本申请实施例1的重组质粒构建策略图谱；图2是本申请实施例2中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36摇瓶发酵的干重-时间检测曲线；其中A为03号菌株、057号菌株、06号菌株及野生型菌株B36摇瓶培养18h起添加DOX的干重-时间生长曲线，B为该四种菌株摇瓶培养42h起添加DOX的干重-时间生长曲线；图3是本申请实施例2中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36摇瓶发酵的目的基因转录水平检测结果；图4是本申请实施例2中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36摇瓶发酵的过表达菌株拷贝数检测结果；图5是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的干重-时间检测曲线；图6是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的CER-时间检测曲线；图7是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的OUR-时间检测曲线；图8是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的目的基因转录水平的检测结果。具体实施方式下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。本申请实施例提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，包括在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。本文中，“葡萄糖淀粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，其特征在于，包括：在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，其特征在于，包括：在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因An14g03240基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因An04g05720基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因An03g06460基因中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，，所述方法包括：将所述脂肪酸代谢途径调控基因插入到含有可诱导表达Tet-on系统的质粒中，并导入到黑曲霉菌株，使所述脂肪酸代谢途径调控基因在所述黑曲霉菌株中过表达。


5.一种糖化酶生产能力提高的重组黑曲霉菌株，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳立明，祁洁，隋雨菲，肖贤尊，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31