基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件制造技术

本发明专利技术利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合蛋白，融合蛋白包括葡萄糖氧化酶和CBM，进而以纳米纤维素膜作为融合蛋白的固定化载体，用于制备生物传感元件，所得到的生物传感元件能够表现出良好的催化特性和检测稳定性。

【技术实现步骤摘要】
基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件
本专利技术涉及氧化还原酶基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因通过连接肽(linker)基因连接，构建氧化还原酶-linker-CBM融合酶，并利用融合酶制备纳米纤维素载体膜特异性结合的生物传感元件，属于生物酶基因工程和生物传感

技术介绍
氧化还原酶是生物传感器中关键的检测敏感元件，其有效固定在载体表面且能持久、高效地保持其活性状态，是生物传感器高稳定性和高灵敏度的重要保证。酶分子元件在电极表面固定化通常是利用物理吸附或共价结合等方式将酶分子随机固定在面积不到一平方厘米的载体膜上。但是，生物活性酶分子具有空间三维结构，结合底物的活性中心具有特定取向，酶分子通过非特异性物理吸附或共价结合与载体相互作用常隐藏掉酶分子活性中心或使其不能正确取向，导致酶活大量损失，生物传感器稳定性较差。近年来，利用生物亲和吸附进行酶的固定化引起越来越多的关注，其最大优势是酶分子可与载体材料特异性结合、固定化方向可控以及酶分子构象改变最小。碳水化合物结合模块(Carbohydrate-BindingModules，CBM)是天然碳水化合物活性酶分子中没有催化活性，但能在酶分子识别和定向结合底物中发挥重要作用的功能模块，CBM数量众多，对结晶或非晶纤维素、几丁质、木聚糖等多糖具有结合特异性，目前碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org)收录了大约10万条CBM序列，根据氨基酸序列相似度(>30％)归入86个家族，92个CBM结构得到解析(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)。在天然酶分子中CBMs可以以单独模块或者位于同一家族或不同家族的串联模块连接到催化模块N端或C端，随着分子生物学、合成生物学、计算机辅助模拟等技术发展，目前研究者基于序列结构等生物大数据的挖掘与分析，结合动力学模拟分析蛋白质整体与局域分子动态学行为，建立CBM与目标酶分子的精准嫁接的杂合体文库，并利用融合DNA技术试图获得多种多样CBM与酶分子融合蛋白，以此提高酶分子与底物亲和力、酶分子稳定性或酶活。利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶，并以纳米纤维素膜作为融合酶分子固定化载体，提高酶电极传感器稳定性的改造策略目前国内外几乎未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于生物传感元件的融合蛋白，所述融合蛋白包括葡萄糖氧化酶和碳水化合物结合模块(CBM)。在一个实施方式中，所述葡萄糖氧化酶(GOD)和CBM通过连接肽连接。在一个实施方式中，所述GOD来源于AspergillusnigerAn76，优选的，所述GOD的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码基因序列如SEQIDNo.2所示。在一个实施方式中，所述CBM选自第2家族CBM，优选的，所述CBM的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，其编码基因序列如SEQIDNo.4所示。所述连接肽选自(GGGGS)2、(EAAAK)3或选自Thermobifidafusca基因组中内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域和CBM2结构域的天然linker序列中的一种或任意几种；优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，其编码基因如SEQIDNo.6所示。在优选的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。另一方面，本专利技术还提供了上述融合蛋白的编码基因，所述融合蛋白的编码基因序列如SEQIDNo.8所示。另一方面，本专利技术还提供了上述融合蛋白的制备方法，其包括将编码基因转化到毕赤酵母中，然后进行表达纯化的步骤。另一方面，本专利技术还提供了一种基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件，所述生物传感元件包括上述用于生物传感元件的融合蛋白。进一步的，所述生物传感元件还包括纤维素膜。另一方面，本专利技术还提供了上述用于生物传感元件的融合蛋白在制备生物传感元件中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种制备基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件的方法，所述方法包括将上述融合蛋白与纤维素膜接触制备成为融合蛋白与纤维素膜的复合物、然后将复合物固定到电极上的步骤。在优选的实施方式中，在所述融合蛋白与纤维素膜的复合物中，所述纤维素膜作为融合蛋白的固定化载体。在优选的实施方式中，将上述融合蛋白溶液添加到纤维素膜上，干燥后即得到固定了融合蛋白的纤维素膜，然后将固定了融合蛋白的纤维素膜固定到电极上即得到上述生物传感元件。序列信息如下：SEQIDNo.描述1GOD氨基酸序列2GOD核酸序列3CBM氨基酸序列4CBM核酸序列5连接肽氨基酸序列6连接肽核酸序列7GOD-NL-CBM2氨基酸序列8GOD-NL-CBM2核酸序列附图说明图1.SDS-PAGE检测异源表达的葡萄糖氧化酶；其中(a)预测的野生型葡萄糖氧化酶(GOD)结构；(b)预测的融合葡萄糖氧化酶(GOD-NL-CBM2)结构；(c)条带M:蛋白标准物，50mM咪唑洗脱GOD的SDS-PAGE检测图谱；(d)20mM咪唑洗脱GOD-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱；(e)浓缩GOD和GOD-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱。图2.GOD和GOD-NL-CBM2最适温度、最适pH测定；(a)，(b)分别为GOD、GOD-NL-CBM2和固定化GOD-NL-CBM2最适pH、最适温度测定；(c)，(d)分别为SDS-PAGE检测不同pH、不同温度反应体系下GOD和纤维素反应后上清中蛋白含量；(e)，(f)分别为SDS-PAGE检测不同pH、不同温度反应体系下GOD-NL-CBM2与纤维素混合上清中蛋白含量。图3.纤维素膜未与或与葡萄糖氧化酶反应后形貌和组成特征分析；(a1)，(a2),(a3)分别为未与葡萄糖氧化酶反应的纤维素膜SEM，EDS和FTIR检测结果；(b1)，(b2)，(b3)分别为纤维素膜与GOD反应后的SEM，EDS和FTIR检测结果；(c1)，(c2)，(c3)分别为纤维素膜与GOD-NL-CBM2反应后的SEM，EDS和FTIR检测结果。图4.GOD-NL-CBM2/纤维素膜生物电极电化学行为分析；(a)利用橡胶圈将固定化GOD-NL-CBM2的纤维素膜固定于铂电极(H2O2电极)上的模式图；(b)裸电极、纤维素膜/电极、GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极ESI检测结果；(c)GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极在PBS和40mM葡萄糖溶液中的循环伏安图。图5.GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极对葡萄糖的电流响应结果；(a)，(b)，(c)，(d)分别为葡萄糖浓度在1.25mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生物传感元件的融合蛋白，所述融合蛋白包括葡萄糖氧化酶(GOD)和碳水化合物结合模块(CBM)，所述GOD和CBM通过连接肽连接。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于生物传感元件的融合蛋白，所述融合蛋白包括葡萄糖氧化酶(GOD)和碳水化合物结合模块(CBM)，所述GOD和CBM通过连接肽连接。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述GOD来源于黑曲霉(Aspergillusniger)An76。


3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述CBM选自第2家族CBM。


4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽选自(GGGGS)2、(EAAAK)3或SEQIDNo.5所示的序列。


5.一种制备权利要求1或4任一所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括将所述融合蛋白的编码基因转化到毕赤酵母中...

【专利技术属性】
技术研发人员：公维丽，马耀宏，蔡雷，王丙莲，孟庆军，刘庆艾，郑岚，杨艳，杨俊慧，李一苇，史建国，韩庆晔，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37