一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法技术

本发明专利技术提供一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒，基础合成材料为摩尔比8：1～1：1的磷脂和胆固醇，所述磷脂为DPPC或者PC‑98T；制备Mal‑PEG2000‑DSPE脂质体胶束，利用LHRH肽修饰所述胶束，利用LHRH肽与Mal‑PEG2000‑DSPE交联后的胶束修饰脂质体。本发明专利技术通过设计适于经鼻递送一直到肺部给药的基因药物和疫苗分子载体，使其能够以温和方便的给药方式，顺利克服肺部的各种生理障碍直接作用于效应细胞，以促进生物大分子类药物的实际应用效率，提高疾病的治疗或预防效果。

【技术实现步骤摘要】
一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法
本专利技术涉及生物制品
，尤其涉及一种可鼻喷的脂质纳米颗粒制备方法。
技术介绍
随着生物医药领域的高速发展，生物治疗药物占整个医药市场的比例越来越大。生物大分子药物，特别是蛋白多肽类药物与新兴的基因药物DNA，mRNA、microRMA,siRNA以及shRNA具有广阔的应用前景。但是生物大分子药物不稳定，易受环境中多种因素的影响而失活，因而半衰期都很短，限制了该类药物的实际应用。常规的静脉注射给药方式，又存在生物利用度低等问题，且由于半衰期短所造成的反复给药，又给患者造成生理上的痛苦。根据不同的药物选择合适的运载系统与给药方法可以提高生物大分子药物的生物利用度，改善治疗效果。鼻内给药途径是多种药物进行局部和系统给药的切实可行的给药途径。鼻粘膜表面积可以使药物迅速发挥治疗效果，还可以对中枢神经系统进行直接给药，不具有侵袭性，不需要进行无菌操作，给药方便简单，可以大大提高对患者进行给药的方便性、舒适性和顺应性。目前市场上有很多在售鼻喷药物，通常鼻部给药主要治疗上呼吸道的局部疾病，比如鼻塞，鼻部感染，鼻部过敏性疾病如过敏性鼻炎等。而在过去的几十年间，人们也在探索通过鼻腔给药进行小分子药物系统给药的方法。鼻粘膜具有高度血管化和高透过性，因此也可以通过该途径进行系统给药，使鼻部既成为治疗靶点又是药物入口。经鼻到肺部给药途径是将药物直接运送至肺部进行治疗或输送的给药方式。由于肺部与外界环境直接接触，易于受到各种病原菌和有害物质的侵袭，理论上其同样也易于接受外界药物的治疗。肺部给药途径是很有应用前景的给药途径，在进行肺部疾病治疗时，可以将药物直接投送到患病部位，较易接触药物，且药物吸收快，使药物直接发挥作用，因而可以降低药物用量，同时也会降低刺激性药物对其他组织的系统副作用，和对其他正常器官的不良作用。肺部局部代谢活性低，无口服给药途径所产生的首过代谢效应，也较适于作为活性药物成分(API)如蛋白多肽和基因等易降解药物的给药部位。经肺部给药途径可以作为治疗哮喘和细菌感染，等肺部疾病的给药方式。肺部给药的主要形式有吸入给药，鼻内给药和气管内给药。肺部给药的成功与否在很大程度上也取决于肺部给药设备的开发，只有开发出一种高效方便的肺部给药设备才可以将合适的载体运送至肺部产生作用。近年来，随着生物
的发展促进了一系列治疗和预防多种疾病的生物大分子药物的出现。因此市场上将会出现越来越多的通过鼻和肺内途径给药的生物大分子药物。脂质体是一种人工制备的球状囊泡，是由一种或多种磷脂双分子层或单分子层构成，通常为了改善脂质体的性质还加入胆固醇。由于脂质体生物相容性好，无毒可降解，可以装载亲水和疏水药物，并有一定的靶向性，脂质体非常适合作为多种生物活性药物的运送载体如蛋白多肽，核酸等，目前已有多种脂质体类药物上市如阿霉素和两性霉素脂质体药物。脂质体具有多种分类，按照其磷脂双分子层的不同可以分为单室脂质体和多室脂质体，粒径分布在25nm到10μm之间，但是药物运送的理想脂质体粒径分布则在50–200nm之间，根据所带电荷性质的不同又可分为中性，阳离子型和阴离子型脂质体。作为药物载体，脂质体可以将亲水性的生物大分子药物装载入其水溶液核心中，保护生物大分子的结构不被破坏，除了传统的脂质体以外，现在又出现了许多功能型的脂质体载体类型如隐形脂质体，长循环脂质体，配体靶向型脂质体，缓释脂质体以及多功能的脂质体。另外还有新型的脂质载体如固态脂质纳米颗粒和纳米结构脂质载体。许多基因药物或疫苗(mRNA、iRNA和microRNA)通过鼻喷的治疗效果必须有合适的载体才能达到，所以本专利技术针对基因治疗药物或基因疫苗，选择合适的脂质体作为载体，以期可以通过选择与鼻黏膜和肺部表面较为接近的活性剂组成类似的磷脂材料，来制备脂质体，一方面提高载体的安全性，另一方面促进药物能够顺利克服鼻和肺部粘膜的阻碍，使药物作用于疫苗传递或肺部本身疾病，如肺癌细胞，以提高基因药物的实验效果。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于，提供一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，经鼻递送给药方式，经鼻和肺粘膜进入体内，以提高RNA类生物大分子的稳定性和生物利用度，改善疫苗预防或药物的治疗效果。本专利技术的第二个目的在于，提供一种由上述方法制备获得的可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒。本专利技术的第三个目的在于，提供可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，包括如下步骤：(1)利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒，基础合成材料为摩尔比8：1～1：1的磷脂和胆固醇，所述磷脂为DPPC或者PC-98T；(2)制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束，利用LHRH肽修饰所述胶束，利用LHRH肽与Mal-PEG2000-DSPE交联后的胶束修饰脂质体。作为一个优选方案，基础合成材料还包括和胆固醇相同摩尔比的DODAP。脂质体只要通过疏水相互作用和静电相互作用与所载物质结合，DODAP作为脂质体中的脂质分子，携带含一个正电荷的基团，为脂质体提供正电，使得制备的LNP系统可有效包封负电荷的核酸及表面电荷低，从而克服了直接混合所得复合体的许多问题。作为一个优选方案，DPPC或者PC-98T与胆固醇的摩尔比优选为3:1。作为一个优选方案，步骤(1)中将基础合成材料溶于三氯甲烷中，40℃旋蒸2h制备脂质膜，加入水，磁力搅拌水化处理，制备初级的脂质体悬浮液，高压匀浆，利用200nm聚碳酸脂膜过滤以除去大颗粒杂质，或者用200nm聚碳酸脂膜过滤10遍，并过450nmPVDF膜进行除菌，脂质体悬液置于4℃保存。作为一个优选方案，制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束包括：(1)取1μmol/mL的mal-PEG2000-DSPE储备液2mL，回复至室温后，置于圆底烧瓶中，补加3mL氯仿，充分混匀；(2)利用真空旋转蒸发仪对上述Mal-PEG2000-DSPE溶液进行旋蒸成膜，水浴温度37℃，旋蒸1h，充分除去有机溶剂；(3)成膜后，先进行超声处理5min，以使脂膜充分脱落，便于水化，利用HEPES缓冲液进行水化，水化温度60℃，持续水化2h以充分水化；(4)水化后，利用超声清洗机进行超声处理10min，温度60℃；(5)200nm聚碳酸脂膜过滤，除去较大颗粒，转入无菌离心管，4℃保存备用。为了实现上述第二个目的，本专利技术提供了利用所述可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法制备获得的脂质纳米颗粒。为了实现上述第三个目的，本专利技术提供了脂质纳米颗粒在制备RNA类基因药物和疫苗分子经鼻递送给药方式药物载体中的应用。PC-98T：蛋黄卵磷脂——第一代天然磷脂，与普通的蛋黄卵磷脂不同的是，PC-98T的制取过程摒弃了乙醇胺磷脂(PE)、甘油磷脂(PG)、丝氨酸磷脂(PS)等所有其他类型的磷脂，仅保留了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒，基础合成材料为摩尔比8：1～1：1的磷脂和胆固醇，所述磷脂为DPPC或者PC-98T；/n(2)制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束，利用LHRH肽修饰所述胶束，利用LHRH肽与Mal-PEG2000-DSPE交联后的胶束修饰脂质体。/n

【技术特征摘要】
1.一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒，基础合成材料为摩尔比8：1～1：1的磷脂和胆固醇，所述磷脂为DPPC或者PC-98T；
(2)制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束，利用LHRH肽修饰所述胶束，利用LHRH肽与Mal-PEG2000-DSPE交联后的胶束修饰脂质体。


2.根据权利要求1所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于，基础合成材料还包括和胆固醇相同摩尔比的DODAP。


3.根据权利要求1或2所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于，DPPC或者PC-98T与胆固醇的摩尔比为3:1。


4.根据权利要求1或2所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于，步骤(1)中将基础合成材料溶于三氯甲烷中，40℃旋蒸2h制备脂质膜，加入水，磁力搅拌水化处理，制备初级的脂质体悬浮液，高压匀浆，利用200nm聚碳酸脂膜过滤以除去大颗粒杂质，或者用200nm聚碳酸脂膜过滤10遍...

【专利技术属性】
技术研发人员：安有才，王帅，吴浩飞，徐奇，赵章婷，
申请(专利权)人：江苏中慧元通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32