一种用于治疗庞贝氏病的产品制造技术

本申请公开了一种用于治疗庞贝氏病的产品。所述产品中包含：能够将目的基因插入到肝细胞的Alb(Albumin,白蛋白)基因的13号内含子上并使所述目的基因与Alb共表达的试剂；所述目的基因包括GAA(Acid α‑glucosidase,酸性α‑葡萄糖苷酶)的编码基因。本申请选择肝细胞中Alb基因的13号内含子作为目的基因插入位点，并根据该位点设计的整合供体序列可以保证Alb的完整表达且与外源目的基因共表达，从而实现在不破坏内源基因表达的前提下实现目的基因高表达的目的。本申请所提供的产品可以改善庞贝氏病的症状，具有较高的效率和较好的安全性，在临床治疗方面具有很好的应用前景。

A product for the treatment of Pompeii's disease

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗庞贝氏病的产品
本专利技术涉及基因治疗领域，具体涉及一种可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病治疗和/或预防产品，尤其涉及一种用于治疗庞贝氏病的产品。
技术介绍
庞贝氏病(Pompedisease)是一种由酸性α葡萄糖苷酶(GAA)基因发生突变引起的严重代谢性肌病，以荷兰病理学家JohannesCassianusPompe的名字命名。GAA在正常代谢中存在于溶酶体内，在溶酶体的酸性环境中分解糖原，为机体提供能量。GAA的缺乏将在多个组织中导致溶酶体内出现糖原积累，其中心脏和骨骼肌受到的影响最为严重。因此，这种疾病也被称为II型糖原储积症(TypeIIglycogenstoragedisease,GSDII)或酸性麦芽糖酶缺乏症(Acidmaltasedeficiency)。由于心肌，骨骼肌和神经系统中出现糖原积累，故而肌肉组织和神经系统是出现退行性病状的典型。患者心肌往往会由于代偿性增生导致心肌肥大，舌头也往往变得肥大；肌肉功能出现明显退化，表现为肌无力，呼吸功能减弱，神经细胞数量减少，患者体重也往往轻于正常人，给患者造成严重的生存负担。所以对于重症庞贝氏病患者来说，亟需一种能够有效治愈的方法。目前，酶替代治疗是临床上唯一有效的治疗手段，但是存在一定的副作用，价格昂贵且效果有限。而定点整合的基因治疗为这类疾病的治疗提供了新的选择。在基因治疗的尝试上，先前研究已经发现采用肝脏作为分泌器官过表达人GAA(humanGAA,hGAA)蛋白可以实现庞贝氏病的体内代谢交叉校正。而针对定点整合的治疗，选择肝脏中高表达蛋白Alb(白蛋白)基因作为插入位点是一个新的尝试。然而之前的与肝脏相关的代谢类疾病研究大都采用同源重组的方式，无法在非分裂细胞中插入，因而在成体肝细胞中修复效率较低。此外，由于较长同源臂的存在，无法通过rAAV病毒载体递送更大片段的cDNA来治疗更多的疾病；或者目前进行的ZFN修复肝代谢类疾病的临床试验通常需要导入三个病毒系统，相比CRISPR更为复杂，且靶向整合效率不到0.5％，不适用于编辑细胞需求更高的遗传疾病。现有技术：“US20190225991A1METHODSANDCOMPOSITIONSFORGENOMEEDITINGINNON-DIVIDINGCELLS.”公开了一种HITI(homology-independenttargetedintegration，非同源依赖的靶向整合)技术：在基因组上sgRNA的靶序列通常长度为20bp，而Cas9的切割是发生在PAM序列(NGG)上游3bp处，因此就将靶点序列分为了17bp与6bp两段。如果不存在供体序列(donor)，细胞可以通过非同源末端连接(NHEJ)的方式进行修复；如果提供外源的donor，且donor上的目的片段两端存在同基因组反向的CRISPR/Cas9识别序列，则在将CRISPR/Cas9系统及donor导入细胞后，细胞基因组和donor均会被切割，产生平末端的DNA双链断裂(Doublestrandbreak，DSB)。由于不存在同源模板，此时两个平端接口之间会发生NHEJ的修复，连接方式会有正向与反向两种，如果修复是正向连接的，那么就会破坏CRISPR/Cas9识别序列并终止切割并实现外源基因的整合；如果修复是反向连接的，则会修复CRISPR/Cas9识别序列并继续在靶点处进行切割，直到最终出现正向的连接修复为止，这种方式被称为HITI。由于HITI是基于NHEJ通路，因而可以在非分裂细胞中实现高效的外源基因靶向敲入，不需要同源臂，且实验证明HITI介导的体外基因整合效率高达90％，远高于传统的同源重组。现有的HITI技术只提供了整合的方式(或策略)，但是对于具体的插入位点的选择，插入片段的优化以及结合位点产生的插入或缺失(insertionsanddeletions,indels)等问题上没有进行详细的讨论与研究。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种用于治疗庞贝氏病的产品。本专利技术旨在基本不破坏内源蛋白表达的前提下(之前文献报道的其它方案都在敲入基因的同时对内源蛋白表达进行了破坏)，通过HITI这一高效的非同源整合策略，建立一个更为安全、有效的庞贝氏病治疗平台。本专利技术产品具有如下优势：基本不破坏内源蛋白表达；在分裂细胞和非分裂细胞中都能实现外源基因的高效整合；hGAA蛋白可实现长期的表达和分泌。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一方面，本专利技术提供一种治疗和/或预防可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病的产品，包含：能够将目的基因插入到肝细胞中Alb基因的13号内含子上并使所述目的基因与Alb共表达的试剂；所述目的基因包括可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病中突变或缺乏的基因；或其它可通过所述与Alb共表达实现疾病治疗的基因如F9因子的编码基因；所述可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病具体可包括庞贝氏病、Huler综合征、Hunter综合征、戈谢病(葡糖脑苷脂病)、Sanhoff病、Niemann-Pick病、Fabry病、Farber病等；其中，F9因子为一种凝血因子，F9因子缺乏会导致B型血友病，由于在本申请之前已经申请了专利：一种用于治疗B型血友病的产品(申请号为201911055309.X，申请日为2019年11月1日)，其中的目的基因为F9因子的编码基因，因此，本申请中不再对其进行重复保护。在一种实施方式中，所述可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病包括庞贝氏病，所述突变或缺乏的基因包括GAA的编码基因，优选的，所述GAA的编码基因序列如SEQIDNo.6所示。在上述产品中，所述试剂包括：核酸酶和sgRNA，和/或所述核酸酶的递送载体和所述sgRNA的递送载体；所述sgRNA能够引导所述核酸酶对肝细胞中Alb基因的13号内含子进行切割并形成断裂位点；优选的，所述sgRNA的靶序列包含SEQIDNo.1-5(即sg6，sg7，sg10，sg11，sg15)中任一所示的序列；更优选的，所述sgRNA的靶序列包含SEQIDNo.2(即sg7)所示的序列。在上述产品中，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为Cas9，更优选的，所述Cas9选自来源于化脓性链球菌、和/或肺炎链球菌、和/或嗜热链球菌的Cas9，更优选的，所述Cas9选自来源于化脓性链球菌的Cas9。在上述产品中，所述试剂包括：供体修复模板、和/或所述供体修复模板的递送载体，所述供体修复模板包括依次连接的Alb基因的14号外显子编码序列和所述目的基因的编码序列，优选的，所述Alb基因的14号外显子编码序列如SEQIDNo.7所示；优选的，所述供体修复模板中所述Alb基因的14号外显子的上游设SA序列，更优选的，所述SA序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗和/或预防可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病的产品，其特征在于，所述产品中包含：能够将目的基因插入到肝细胞中Alb基因的13号内含子上并使所述目的基因与Alb共表达的试剂；/n所述目的基因包括可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病中突变或缺乏的基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗和/或预防可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病的产品，其特征在于，所述产品中包含：能够将目的基因插入到肝细胞中Alb基因的13号内含子上并使所述目的基因与Alb共表达的试剂；
所述目的基因包括可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病中突变或缺乏的基因。


2.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述可用肝脏进行代谢交叉校正治疗的疾病包括庞贝氏病，所述突变或缺乏的基因包括GAA的编码基因，
优选的，所述GAA的编码基因序列如SEQIDNo.6所示；
优选的，所述产品具有改善所述庞贝氏病的包括如下a-e症状中的至少一种：
a体重减轻，
b肌肉力量丧失，
c血浆中GAA蛋白活性降低，
d肝脏、心肌、膈肌、股四头肌、舌、脑、和/或脊髓中GAA蛋白活性降低，
e肝脏、心肌、膈肌、股四头肌、舌、脑、和/或脊髓中糖原升高。


3.如权利要求1或2所述的产品，其特征在于，所述试剂包括：核酸酶和sgRNA，和/或所述核酸酶的递送载体和所述sgRNA的递送载体；
所述sgRNA能够引导所述核酸酶对肝细胞中Alb基因的13号内含子进行切割并形成双链断裂位点；
优选的，所述sgRNA的靶序列包含SEQIDNo.1-5中任一所示的序列；
更优选的，所述sgRNA的靶序列包含SEQIDNo.2所示的序列。


4.如权利要求3所述的产品，其特征在于：所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种；
优选的，所述核酸酶为Cas9，更优选的，所述Cas9选自来源于化脓性链球菌、和/或肺炎链球菌、和/或嗜热链球菌的Cas9，更优选的，所述Cas9选自来源于化脓性链球菌的Cas9。


5.如权利要求3或4所述的产品，其特征在于：所述试剂包括：供体修复模板、和/或所述供体修复模板的递送载体，
所述供体修复模板包括依次连接的Alb基因的14号外显子编码序列和所述目的基因的编码序列；
优选的，所述Alb基因的14号外显子编码序列如SEQIDNo.7所示；
优选的，所述供体修复模板中所述Alb基因的14号外显子的上游设SA序列，更优选的，所述SA序列如SEQIDNo.8所示；
优选的，所述供体修复模板中所述Alb基因的14号外显子与所述目的基因之间设自剪切多肽编码基因，更优选的，所述自剪切多肽为2A多肽，更优选的，所述2A多肽为P2A(猪捷申病毒(porcineteschovirus)2A样多肽)、T2A(明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasignavirus)2A样多肽)、E2A和/或F2A，更优选的，所述2A多肽为T2A多肽，更优选的，所述T2A多肽的编码基因序列如SEQIDNo.9所示，
更优选的，所述自剪切多肽编码基因3’端与所述目的基因5’端之间连接分泌肽编码基因，更优选的，所述分泌肽的编码基因序列如SEQIDNo.26所示；
优选的，所述供体修复模板中所述目的基因下游设polyA序列，更优选的，所述polyA为bGH-polyA，更优选的，所述bGH-polyA序列如SEQIDNo.10所示。


6.如权利要求5所述的产品，其特征在于：所述供体修复模板包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李大力，牛煦然，陈曦，席在喜，刘明耀，
申请(专利权)人：华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31