一种测定MSC组织分布的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定MSC组织分布的方法：（1）将人间充质干细胞输注实验鼠体内，每隔一定时间对需监测器官或组织取样并提取DNA样品；（2）以确定数量的人间充质干细胞提取DNA并稀释成系列浓度的DNA溶液；（3）以如SEQ ID NO:1和2所示序列为引物，以步骤（1）中的DNA样品和步骤（2）中的DNA溶液为模板进行实时荧光定量PCR；（4）步骤（2）中系列浓度的DNA溶液的CT值制作标准曲线，计算步骤（1）中DNA样品的数量。本发明专利技术对组织中间充质干细胞的绝对定量，可以检测间充质干细胞在各个组织中的定植率和体内各个组织中随时间的代谢情况，为临床方案中给药途径和剂量的设计提供了参考依据。药途径和剂量的设计提供了参考依据。药途径和剂量的设计提供了参考依据。

【技术实现步骤摘要】
一种测定MSC组织分布的方法


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种定量测定MSC组织分布的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种来源于中胚层的多能性干细胞，具有良好的自我更新以及多向分化能力。因其来源范围广，具备多向分化潜能以及强大的归巢能力，使其在临床治疗中得到了很好的应用。干细胞作为药物申报，需要依赖于动物进行临床前研究，尤其是药物水平有效性和药物代谢水平的研究。目前运用同位素示踪、小动物活体成像、普通PCR等技术已经可以实现细胞的在体或离体示踪，然而这些示踪也仅仅是停留在对细胞的定性以及相对定量层面，无法实现对组织中细胞含量进行精确定量。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中无法精确定量组织中间充质干细胞数量的问题，本专利技术提供一种定量测定MSC组织分布的方法，采用实时荧光定量PCR。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0005]一种测定MSC组织分布的方法，包括以下步骤：（1）将人间充质干细胞输注实验鼠体内，每隔一定时间对需监测器官或组织取样并提取DNA样品；（2）以确定数量的人间充质干细胞提取DNA并稀释成系列浓度的DNA溶液；（3）以如序列SEQ ID NO:1和2所示的序列为引物，以步骤（1）中的DNA样品和步骤（2）中的DNA溶液为模板进行实时荧光定量PCR；（4）步骤（2）中系列浓度的DNA溶液的CT值制作标准曲线，计算步骤（1）中DNA样品的数量。
[0006]所述实验鼠选自小鼠、大鼠或裸鼠。
[0007]所述人间充质干细胞的来源不限，优选为胎盘、脐带、骨髓、脂肪或血液。
[0008]优选的，所述人间充质干细胞的流式细胞检测为CD73、CD105、CD44、CD90阳性率均在98%以上，CD34、CD45、HLA
‑
DR检测阴性率在0.2%以下。
[0009]所述实时荧光定量PCR以SYBR Green为荧光染料。
[0010]本专利技术具有以下优点：本专利技术的以人鼠基因差异性为基础，选择间充质干细胞特异的表面标记物基因CD105为扩增的目的基因。从CD105基因中选择小鼠缺失严重而人序列保持完整的CD105片段上进行引物设计，用作实时荧光定量PCR扩增的引物，特异性高、检测限低。
[0011]本专利技术的方法运用实时荧光定量PCR技术代替了普通的PCR技术，通过人鼠基因差异性设计人源基因特异性引物进行实时荧光定量PCR，实现了对组织中间充质干细胞定植率的绝对定量。设计的引物特异性高，对人间充质干细胞的定量更加精确。本专利技术对组织中间充质干细胞的绝对定量，可以追踪细胞在体内各个组织中随时间的代谢情况和在各个组
织中的定植率，为干细胞药物开发中的药代动力学研究提供了方法学支持，为临床方案中给药途径和剂量的设计提供了参考依据。
附图说明
[0012]图1为间充质干细胞的培养与表型鉴定结果；图2为各引物对获得的溶解曲线；图3为各引物对获得的标准曲线；图4为引物对1的特异性验的溶解曲线；图5为不同组织中间充质干细胞含量。
具体实施方式
[0013]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0014]实施例1 检测引物的确定（1）将图1所示流式检测CD73、CD105、CD44、CD90阳性率均在98%以上，CD34、CD45、HLA
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DR检测阴性率在0.2%以下的来源于人脐带的间充质干细胞1
×
107个，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304，天根生化科技（北京）有限公司）提取DNA，计算DNA总量，然后对半稀释9次后，获得10个系列浓度的DNA标准溶液；（2）分别根据SEQ ID NO:7
‑
9为目的序列设计序列如下表所示三对引物对并合成：以步骤（1）中的DNA标准溶液为模板进行实时荧光定量PCR，反应体系如下：扩增反应如下：
熔解曲线获取反应如下：95℃、15min，预变性；60℃、60s，退火；0.15℃/s升至95℃，每5s采集一次信号；（3）将3对引物的熔解曲线如图2所示（a为引物对1，b为引物对2，c为引物对3），将系列浓度的DNA溶液根据DNA质量换算为细胞数量，以间充质干细胞数量的LOG值为横轴，CT值为纵轴制作标准曲线，如图3所示。
[0015]根据图2和图3可以，引物1的检测限在0.195ng以下；而且在检测浓度内没有出现非特异性扩增；引物2的能够检出约0.781ng的DNA，当低于该浓度时，出现了引物二聚体；而引物3仅能够检测出12.5ng的DNA，当低于该浓度时，出现了引物二聚体。由此可见，针对CD105的引物，第1对引物的检测线更低。
[0016]实施例2 重复性检测对第一对引物进行重复性检测，同样取实施例1中10个系列浓度的DNA标准溶液，按照实施例1中的方法进行扩增实验，获得的熔解曲线如图4所示，通过熔解曲线可知，引物对1没有非特异性扩增，可以用于对方法的评价，根据各标准溶液的Ct值计算变异系数（CV）。当DNA量从0.19ng到100ng变化时，变异系数从0.97%到2.76%，小于3%，能够用于后续定量检测。
[0017]实施例3 间充质干细胞组织分布的定量检测（1）将图1所示流式检测CD73、CD105、CD44、CD90阳性率均在98%以上，CD34、CD45、HLA
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DR检测阴性率在0.2%以下的来源于人脐带的间充质干细胞进行输注，调节注射液中细胞密度为1
×
107cells/mL，以BALB/c
‑
nude裸鼠（雌鼠）为试验对象，尾静脉注射，每只注射体积：200μL，共15只；注射后24h、48h、72h、96h、120h，每个时间点随机选择3只裸鼠麻醉后引颈处死，取其心、肝、脾、肺、肾组织，冲洗血污后吸净水分，称重后冻存于
‑
80℃；完成全部取样后，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304，天根生化科技（北京）有限公司）提取DNA；（2）以SEQ ID NO:1
‑
2所示的序列为引物，按照实施例1中的方法进行qPCR；（3）根据实施例1中的标准曲线y=
‑
3.3853x+32.291（R2=0..995）计算步骤（1）中DNA样品的数量，然后根据提取DNA所使用的样品重量计算单位组织中间充质干细胞的数量，检测结果如附图5所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定MSC组织分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将人间充质干细胞输注实验鼠体内，每隔一定时间对需监测器官或组织取样并提取DNA样品；（2）以确定数量的人间充质干细胞提取DNA并稀释成系列浓度的DNA溶液；（3）以如序列SEQ ID NO:1和2所示的序列为引物，以步骤（1）中的DNA样品和步骤（2）中的DNA溶液为模板进行实时荧光定量PCR；（4）步骤（2）中系列浓度的DNA溶液的CT值制作标准曲线，计算步骤（1）中DNA样品的数量。2.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲纳，温丁可，韩镇，谭毅，马贺然，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：