多重基因破坏曲霉属微生物及其制造方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物、以及用于该转化曲霉属微生物的使用的组合物。上述目的是通过染色体上的至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属(Aspergillus)微生物、以及包含至少两种在同源重组区域之间包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段的曲霉属微生物转化用组合物而实现，其中所述选择标记基因包括色氨酸生物合成基因和与色氨酸生物合成基因不同的基因。色氨酸生物合成基因不同的基因。色氨酸生物合成基因不同的基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多重基因破坏曲霉属微生物及其制造方法


[0001]本专利技术涉及一种染色体上的至少两种基因被破坏的转化曲霉属微生物及其制造方法。

技术介绍

[0002]曲霉属(Aspergillus)微生物是在酱油或味噌等发酵食品的制造步骤之一的制麹步骤中所使用的麹菌，另外还被用于各种各样的物质生产。因此，需要一种改变曲霉属微生物的技术以便对位于染色体上的靶基因加以破坏等而表现出所期望的性状。
[0003]作为将位于宿主染色体上的靶基因加以破坏的方法，有标记循环法(也被称为Maker Recycling法。)。标记循环法是如下的方法：在利用同源重组将靶基因置换成选择标记基因之后，去除选择标记基因，使得转化体的染色体上不残留选择标记基因，再将选择标记基因进行再利用。
[0004]作为标记循环法中所使用的选择标记基因，要求具备可以容易地确认选择标记基因的置换及选择标记基因的去除的系统。作为这种可用于标记循环法的选择标记基因，在曲霉属微生物中是使用pyrG基因。
[0005]曲霉属微生物由于在染色体上具有pyrG基因，因而即使不添加尿苷和/或尿嘧啶(以下有时也表示为尿苷/尿嘧啶)也可以生长，但其会将作为尿苷单磷酸的生物合成中间体的乳清苷5
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单磷酸的类似物即5
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氟乳清酸(5
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FOA)加以代谢而合成出有毒性的5
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氟尿嘧啶(5
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FU)。因此，染色体上有pyrG基因的曲霉属微生物即使在5
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FOA存在的条件下进行培养也不能生长。而染色体上没有pyrG基因的曲霉属微生物不能将5
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FOA加以代谢，因此，虽然在5
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FOA存在的条件下也能生长，但构成尿苷/尿嘧啶的缺陷型。
[0006]作为像pyrG基因这样的可用于标记循环法的选择标记基因，需要是在利用由于其基因表达因而在含有特定药物(5
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FOA等)的环境中不能生长这一特性的、在反选择中可用的选择标记基因。换句话说，如果找不到在反选择中可以使用的药物，则该选择标记基因不能应用于标记循环法。
[0007]利用该性质，用不含有尿苷/尿嘧啶的培养基，对将pyrG基因缺失曲霉属微生物染色体上的靶基因用pyrG基因加以置换后的转化体进行筛选，接着用含有5
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FOA的培养基对所筛选的转化体进行反选择，由此可以获得作为5
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FOA耐药株的靶基因和pyrG基因发生缺失的转化体。
[0008]但是，作为将曲霉属微生物作为对象的标记循环法中所使用的选择标记基因，现状是仅使用上述的pyrG基因。此外，在使用药物的niaD缺失株的反选择或sC缺失株的反选择中，药物的选择压均较弱，因而可见非缺失株的背景生长，因而现状是实际上在标记循环法中几乎不被使用。
[0009]另一方面，在下述专利文献1(该文献的全部公开内容并入本文中。)中，关于将戴尔根霉(Rhizopusdelemar)作为宿主的转化体的描述有：通过确认在5
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氟邻氨基苯甲酸(5
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FAA)存在的条件下有无生长，而对参与色氨酸生物合成的基因即trpC基因有无缺失进行评
价。此外，在下述非专利文献1(该文献的全部公开内容并入本文中。)中，作为选择标记基因，描述有使pyrG基因和精氨酸的生物合成基因即argB基因发生缺失的转化棘孢曲霉。在非专利文献2(该文献的全部公开内容并入本中文中。)中，描述有使黑曲霉(Aspergillusniger)的trpC基因不可逆地发生缺失。在非专利文献3(该文献的全部公开内容并入本文中。)中，描述有关于与曲霉属微生物完全不同的酵母(Saccharomycescerevisiae)中的TRP1标记基因的反选择的使用。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：国际公开第2017/135317号
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献1：TANI等人，AMB Express，2013,3:4，https://amb
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express.springeropen.com/articles/10.1186/2191
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0855
‑3‑4[0015]非专利文献2：GOOSEN等人，《分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)》，1989年，219卷，第282
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288页
[0016]非专利文献3：TOYN等人，《酵母菌(Yeast)》，2000年，16卷，第553
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560页

技术实现思路

[0017]专利技术要解决的课题
[0018]在专利文献1中，根据在5
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FAA存在的条件下的有无生长，对trpC基因缺失株进行筛选。但是，在专利文献1中，没有关于可以将trpC基因作为在标记循环法中使用的能够循环的选择标记基因加以使用的描述。
[0019]此外，关于非专利文献1中所描述的转化棘孢曲霉，发生缺失的argB基因不是可用于标记循环法的选择标记基因。此外，在非专利文献1中，代替argB基因而应用另外的选择标记基因，例如，在参与有许多氨基酸的生物合成的基因中，关于对特定选择标记基因的应用没有任何描述。
[0020]进而，在利用标记循环法将作为宿主生物的曲霉属微生物进行转化时，与pyrG基因相同程度的循环是可能的，关于代替pyrG基因的可用的选择标记基因到目前为止几乎是未知的。特别是，关于将曲霉属微生物作为对象，从而可以容易地确认能够与pyrG基因同时使用的可用于标记循环法的选择标记基因的置换和去除的系统，至今为止也几乎未知。关于这些在非专利文献2和3中并没有描述。特别是，根据本专利技术人的调查，与酵母的TRP1标记基因相当的基因在曲霉属微生物中并未发现。
[0021]因此，本专利技术要解决的第一课题在于，提供可用于标记循环法的至少两种选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物及其制造方法。
[0022]本专利技术要解决的第二课题在于，提供使用含有包括选择标记基因的核酸片段的至少两种的组合物，利用标记循环法使位于转化曲霉属微生物染色体上的至少两种靶基因发生缺失的方法。
[0023]用于解决课题的手段
[0024]本专利技术人为解决上述课题而进行努力研究，在设想有应用可能性的各种基因中，最终着眼于参与色氨酸生物合成的基因。于是，发现了：在将该色氨酸生物合成基因发生缺
失的转化曲霉属微生物作为宿主并将包括环出区域和色氨酸生物合成基因的核酸片段导入到靶基因的基因座时，能够利用在色氨酸不存在的条件下的生长来确认靶基因与色氨酸生物合成基因的置换，进而能够利用5
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FAA存在的条件下的生长来确认色氨酸生物合成基因的通过环出的去除。
[0025]于是，出人意料地，本专利技术人通过将5
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FOA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种转化曲霉属微生物，其是染色体上的至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属(Aspergillus)微生物，所述选择标记基因包括色氨酸生物合成基因及与色氨酸生物合成基因不同的基因。2.一种组合物，其是包含至少两种在同源重组区域中包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段的曲霉属微生物转化用组合物，所述核酸片段包括所述选择标记基因是色氨酸生物合成基因的核酸片段及所述选择标记基因是与色氨酸生物合成基因不同的基因的核酸片段。3.根据权利要求1至2中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物，其中，所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)以外的曲霉属微生物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物，其中，所述与色氨酸生物合成基因不同的基因是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因。5.根据权利要求1至4中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物，其中，所述与色氨酸生物合成基因不同的基因是选自尿嘧啶生物合成基因、硫酸盐代谢基因和硝酸盐代谢基因的选择标记基因。6.根据权利要求1至5中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物，其中，所述色氨酸生物合成基因是trpC基因，并且与色氨酸生物合成基因不同的基因是选自pyrG基因、niaD基因和sC基因中的至少一种基因。7.一种包括下述步骤(1)～步骤(3)的、染色体上的可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物的制造方法，该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是色氨酸生物合成基因，另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因：(1)用在同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的核酸片段，将染色体上的第二选择标记基因作为靶，对染色体上的第一选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组，由此获得转化曲霉属微生物的步骤；(2)在与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下，将在所述步骤(1)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养，由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因并且染色体上的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤；以及(3)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下，将在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：原精一，
申请(专利权)人：龟甲万株式会社，
类型：发明
国别省市：