一种人源化抗人BCMA单克隆抗体及其CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术涉及人源化抗BCMA抗原单克隆抗体及其单链可变片段(scFv)，包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的V

【技术实现步骤摘要】
一种人源化抗人BCMA单克隆抗体及其CAR-T细胞


[0001]本专利技术涉及一种能特异性抑制人多发性骨髓瘤及其他BCMA阳性肿瘤细胞生长的新型人源化抗B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体(PMC308)，以及表达含有该单克隆抗体序列的嵌合抗原受体的T免疫细胞(CAR-T细胞)，它们在肿瘤过继免疫治疗中起作用。

技术介绍

[0002]细胞与免疫疗法正在成为治疗癌症的一种具有广阔发展前景的方法。T细胞或T淋巴细胞是我们人体免疫系统细胞免疫的重要组成部分，它通过不断寻找和识别外来、异己抗原，从体细胞中区分正常细胞与异常细胞(癌细胞或受病毒感染细胞)杀灭与清除异常细胞。采用表达嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor)构建体对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的最常见方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞注入患者体内(称为过继细胞转移或ACT)是一种有效的免疫治疗方式
[1,
2]。与化疗或抗体疗法相比，CAR-T技术的优势在于重新编程的工程T细胞可以在患者体内增殖、持续存活并杀伤靶细胞(“活体药物”)
[1,3,4]。
[0003]CAR通常由源于单克隆抗体N端的单链可变片段(scFv)、铰链区、跨膜区和许多细胞内共刺激结构域如(i)CD28，(ii)CD137(4-1BB)、CD27或其他共刺激结构域，以及与其串联的CD3zeta活化结构域组成(图1)
[1,
2]。在图1中，左图为第一代的CAR结构(无共刺激结构域)；中图为第二代的CAR结构(一个共刺激结构域，CD28或4-BB)；并且右图为第三代的CAR结构(两个或多个共刺激结构域)。该图来自Golubovskaya,Wu,Cancers,2016
[6]。CAR经历了从第一代(无共刺激结构域)到第二代(有一个共刺激结构域)，再到第三代(有多个共刺激结构域)的发展历程。携带有两个共刺激结构域(即第三代CAR)及其转染表达的CAR-T细胞的应用使CAR-T的肿瘤杀伤活性增强，CAR-T细胞在体内的持久性延长，并且抗肿瘤疗效提高。
[0004]BCMA
[0005]B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen；BCMA)是一种细胞表面受体，也称为CD269和肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)，它由TNFRSF17基因编码。该受体主要在成熟的B淋巴细胞中表达，在大多数情况下在多发性骨髓瘤(MM)中过表达
[3]。当前针对MM中BCMA的疗法包括单克隆抗体、双特异性抗体和T细胞免疫疗法，CAR-T疗法等
[3,4]。
[0006]BCMA结构和信号通路
[0007]人BCMA蛋白由184个氨基酸组成：第1-54位氨基酸为胞外结构域；第55-77位为跨膜结构域；第78-184位为胞质结构域。BCMA的氨基酸序列如图2所示，其中带下划线的是细胞外结构域。BCMA与BAFF受体、跨膜激活剂、亲环素配体相互作用剂和钙调节剂(TACI)等其他受体类似，缺乏信号肽
[4]。这些受体在B细胞成熟和分化为浆细胞中起主要作用。它们的配体包括BAFF和APRIL，两者均在MM患者中表达增加
[4]。单克隆抗体是通过阻断受体-配体相互作用清除MM细胞，而CAR-T细胞疗法则是通过结合BCMA进而杀死MM细胞。BCMA还能与TRAF1,2,3,5和6相互作用。本专利技术是基于靶向MM细胞表面BCMA的人源化BCMA-CAR-T细胞。
人源化BCMA-CAR-T细胞在scFV中具有人源化抗BCMA scFv序列，使它比小鼠ScFv对人的免疫原性低，更有应用优势。
附图说明
[0008]图1.CAR的结构
[0009]图2.BCMA蛋白的氨基酸序列。
[0010]图3.人源化BCMA CAR构建体的结构。
[0011]图4.用荧光标记的重组BCMA蛋白通过FACS分析检测人源化的BCMA-CAR构建体。
[0012]图5.人源化的BCMA-CAR-T细胞杀死CHO-BCMA细胞但不杀死CHO细胞。
[0013]图6.人源化的BCMA-CAR-T细胞经CHO-BCMA阳性细胞刺激后特异性分泌高水平的IFN-γ。
[0014]图7.人源化的BCMA-CAR-T细胞经多发性骨髓瘤细胞刺激后特异性分泌高水平的IFN-γ，而经BCMA阴性的K562对照细胞刺激前后无显著差异；人源化的BCMA-CAR-T细胞在多发性骨髓瘤细胞系中检测到BCMA，但在白血病或其他癌细胞系中未检测到。
[0015]图8A.人源化的BCMA-CAR-T细胞显著抑制RPMI8226异种移植肿瘤的生长；图8B.人源化的BCMA-CAR-T细胞没有降低小鼠体重。
具体实施方式
[0016]定义
[0017]如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指融合蛋白，其由能与抗原结合的胞外结构域、源于多肽的跨膜结构域(该多肽不同于衍生胞外结构域多肽)、以及至少一个细胞内的结构域组成。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”，“能够与抗原结合的胞外结构域”是指能与某一抗原结合的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知功能为传递信号以引起细胞内生物过程的激活或抑制的任何寡肽或多肽。
[0018]如本文所用，“人源化抗体”是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人天然产生的抗体变体的相似性。
[0019]如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其他区域折叠成特定结构的一个区域。
[0020]如本文所用，“单链可变片段(scFv)”是指由保留结合抗原能力的抗体衍生的单链多肽。scFv的示例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区通过间隔序列连接。用于工程化scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
[0021]如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达引起癌症。
[0022]专利技术人已经基于特异性靶向BCMA的新型人源化BCMA单克隆抗体scFv序列构建了CAR-T细胞。专利技术人构建了人源化的BCMA-CAR-T细胞，以靶向过度表达BCMA肿瘤抗原的癌细胞。本专利技术的人源化的BCMA-CAR-T细胞可特异性高水平分泌针对多发性骨髓瘤癌细胞的细胞因子，并杀死CHO-BCMA阳性的靶细胞，但对BCMA阴性的CHO细胞无作用。
[0023]本专利技术涉及分泌人源化抗人BCMA单克隆抗体的杂交细胞克隆及其分泌产生的单克隆抗体(4C8A4或4C8A10)，其分别包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的人源化V
H
序列和
具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的人源化V
L
序列。在一个实施方式中，人源化抗人BCMA抗体是单链可变片段(scFv)。ScFv可以是V
H-接头-V
L...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化抗人BCMA抗体，其包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的V
H
和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的V
L
。2.一种单链可变片段(scFv)，其包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的V
H
和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的V
L
。3.根据权利要求2所述的scFv，其还包含位于V
H
与V
L
之间的接头。4.根据权利要求3所述的scFv，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。5.一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其从N端至C端包含：(i)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，V，
申请(专利权)人：杭州中柏济元基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：