含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法，所述含氨基或羧基基团物质标记的抗体的制备方法，包括以下步骤：1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；2)将酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；3)将得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP

【技术实现步骤摘要】
含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于体外诊断领域，具体涉及一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]常用的检测用抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，是一种IgG。当抗体结合抗原后，补体与抗体Fc段的补体结合位点结合，对检测试剂造成干扰。此外，Fc段的存在也可能使检测试剂存在假性干扰。
[0003]另外，当前的抗体偶联技术多采用共价偶联。由于抗体表面含有丰富的氨基和羧基，这两类基团也是抗体偶联中使用最多的官能团。通常采用的策略是将固相如磁性微球，聚苯乙烯微球或者酶类等表面的羧基用EDC/NHS活化，再与抗体表面氨基形成稳定的酰胺键。极少会采用EDC/NHS对抗体表面的羧基进行活化，因为抗体表面本身带有氨基，容易产生自交联的情况。由于氨基和羧基在抗体表面是普遍存在的，因此这种偶联方法也是随机的。当标记于抗体的互补决定区时，会使抗体失活。即使标记位于Fc段也会因空间位阻的存在造成免疫活性的降低。
[0004]视黄醇结合蛋白(Retinol
‑
Binding Protein，RBP)是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，可作为肾功能早期损害和监护治疗的指标，还可作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0007]1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；
[0008]2)将步骤1)酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；
[0009]3)步骤2)得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP
‑
F(ab
’
)2；
[0010]4)将步骤3)得到的RBP
‑
F(ab
’
)2与HOOC
‑
(CHCHO)n
‑
NH2共价偶联，形成抗体中间体；
[0011]5)将步骤4)得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。
[0012]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述RBP抗体、胃蛋白酶与酸性缓冲液与的质量比例为(0.5
‑
1)：(0.5
‑
1)：10000，优选为1:1：10000。所述IgG抗体为能与抗原特
异性结合的单克隆抗体，能被胃蛋白酶切成F(ab
’
)2段，且保留结合抗原的活性。
[0013]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述酶切反应的温度为37℃
‑
55℃，优选为37℃，这是酶在37℃时的活性较好；所述酶切反应的时间为0.5
‑
2小时。优选时间为30min，优选时间下，反应程度达到最高，时间再往后，趋于平稳，30min既能充分反应，又能节约试验时间。
[0014]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述酸性缓冲液为pH值在1～7之间的缓冲液，优选为pH3.0，优选后能使胃蛋白酶保留酶切活性，包括但不限于柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris
‑
磷酸盐缓冲液、有机酸缓冲液、氨基酸缓冲液、MES缓冲液，优选为柠檬酸缓冲液，这样优选后胃蛋白酶保留酶切活性可以达到最大。
[0015]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤2)中，所述中性透析缓冲液为pH在6～8之间的缓冲液，包括但不限于磷酸缓冲液、Tris
‑
盐酸缓冲液、巴比妥钠
‑
盐酸缓冲液、硼酸
‑
硼砂缓冲液、MES缓冲液，优选为0.1M的磷酸盐缓冲液pH7.0，这样优选后可以能够保持透析物质的活性。
[0016]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤2)中，所述透析的截留分子量为7000
‑
50000D。
[0017]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤4)中，所述HOOC
‑
(CHCHO)n
‑
NH2中的n为3～100000之间，优选为HOOC
‑
(CH CH O)12
‑
NH2，这样优选后能够使偶联效率更高。
[0018]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤4)中，所述抗体
‑
F(ab
’
)2与HOOC
‑
(CHCHO)n
‑
NH2的质量比例为(0.5
‑
1)：1。优选比例为1：1，优选后，抗体与HOOC
‑
(CHCHO)n
‑
NH2能够充分反应，反应程度最佳；既不会浪费原料又能达到最佳结合效果。
[0019]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤5)中，所述抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质的质量比例为1：(5
‑
10)，优选为1:6，当达到1:6，反应达到最高点，往后趋于平稳，因此1:6时既能节约原料，又能使反应程度达到顶峰。
[0020]在本专利技术的一个具体方案中，其中步骤5)中，所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金，选择不局限，不受原材料太多限制，优选为金属颗粒，能够使获得的标记物质具有更好的分散性，分离能力。
[0021]为了实现上述目的，本专利技术还提供了一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体，所述RBP抗体是通过上述的方法制得；所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球(如乳胶荧光微球)、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金。
[0022]为了实现上述目的，本专利技术还提供了一种RBP免疫层析检测试剂盒，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株RBP单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述标记物垫上包被有所述的含氨基或羧基基团物质标记的另一株RBP单克隆抗体和标记物标记的兔IgG。
[0023]在本专利技术的一个具体方案中，其中所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。
[0024]在本专利技术的一个具体方案中，其中所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。
[0025]在本专利技术的一个具体方案中，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；2)将步骤1)酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；3)步骤2)得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP
‑
F(ab
’
)2；4)将步骤3)得到的RBP
‑
F(ab
’
)2与HOOC
‑
(CHCHO)n
‑
NH2共价偶联，形成抗体中间体；5)将步骤4)得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述RBP抗体、胃蛋白酶与酸性缓冲液与的质量比例为(0.5
‑
1)：(0.5
‑
1)：10000；所述酶切反应的温度为37℃
‑
55℃；所述酶切反应的时间为0.5
‑
2小时；所述酸性缓冲液的pH值在1～7之间，其选自柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris
‑
磷酸盐缓冲液、有机酸缓冲液、氨基酸缓冲液和MES缓冲液中的一种。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述中性透析缓冲液的pH值在6～8之间，其为磷酸缓冲液、Tris
‑
盐酸缓冲液、巴比妥钠
‑
盐酸缓冲液、硼酸
‑
硼砂缓冲液或MES缓冲液。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述HOOC
‑
(CHCHO)n
‑
NH2中n为3～100000之间；所述RBP
‑
F(ab
...

【专利技术属性】
技术研发人员：林斯，付琼，徐亚涛，陶鑫，韩艳华，
申请(专利权)人：北京华科泰生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：