一种特异敲除小鼠附睾头部基因的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种特异敲除小鼠附睾头部1

【技术实现步骤摘要】
一种特异敲除小鼠附睾头部基因的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种特异敲除小鼠附睾头部基因的方法。

技术介绍

[0002]目前：基因敲除小鼠是研究基因功能的重要工具，许多基因的敲除会导致小鼠的死亡，给基因功能的研究带来困难。而条件性敲除小鼠，即只在特定的组织敲除某个基因，即可以使小鼠存活，又可以研究基因的功能。条件性敲除小鼠需要满足两个条件：1，在被敲除基因的序列两端加上loxp位点，即Flox小鼠；2，组织特异性的Cre小鼠。小鼠附睾分为1
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10十个区段，而目前附睾特异性的Cre小鼠仅有Lcn5
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Cre，Lcn5
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Cre在小鼠附睾的4
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5区段表达，因此目前只能在小鼠附睾的4
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5区段特异的敲除特定的基因。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前附睾特异性的Cre小鼠仅有Lcn5
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Cre，Lcn5
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Cre在小鼠附睾的4
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5区段表达Cre，因此目前只能在小鼠附睾的4
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5区段特异的敲除特定的基因。而目前无法在附睾的头部1
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3区段特异的敲除基因，对基因在附睾头部1
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3区段中的功能研究带来不可逾越的困难。
[0004]解决以上问题及缺陷的难度为：建立附睾1
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3区段特异地表达Cre的工具鼠。
[0005]解决以上问题及缺陷的意义为：只有建立附睾头部1
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3区段特异地表达Cre的工具鼠，才能对任意基因在附睾头部1
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3区段中的功能进行研究。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种特异敲除附睾头部基因的方法。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种特异敲除附睾头部基因的方法，所述特异敲除附睾头部基因的方法根据CRISPR/Cas9原理在Lcn9基因的第六个外显子设计了gRNA的靶点：TTGCTTTTTATAGACCATAG。此gRNA序列可以和Lcn9基因的第六个外显子特异的结合，并将Cas9引导至Lcn9基因从而将靶点位置附近DNA双链切断。我们首先将gRNA对应的DNA序列连接到体外的pX330载体，并将连接好的载体在体外纯化。
[0008]进一步，所述特异敲除附睾头部基因的方法再另外构建基因打靶载体，打靶载体和Lcn9基因具有同源臂，可发生同源重组，从而将Cre的基因序列插入到Lcn9基因第六个外显子终止密码子之前。
[0009]进一步，所述特异敲除附睾头部基因的方法将pX330载体和打靶载体同时显微注射到受精卵中，再将注射过载体的受精卵移植到假孕母鼠中，等待基因突变小鼠的出生。
[0010]进一步，所述特异敲除附睾头部基因的方法将得到的出生的F0小鼠进行鉴定，Cre插入成功的F0代小鼠和WT小鼠繁殖生出F1代小鼠，通过PCR和测序的方法鉴定出Cre阳性的F1代小鼠。
[0011]进一步，所述特异敲除附睾头部基因的方法将Cre阳性的F1代小鼠与Rosa26
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tdTomato小鼠杂交，鉴定Cre酶的表达部位；结果显示Cre酶的表达部位同Lcn9表达的部位
一致，Cre酶表达于附睾头部初始段(1
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3区段)。
[0012]结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：组织特异性的基因敲除，需要两种小鼠，一种是组织特异表达的Cre小鼠，另外一种是被敲除基因的Flox小鼠。通过成熟的技术，特定基因的Flox小鼠比较容易获得，而组织特异表达的Cre小鼠是比较难获得的工具鼠。Lcn9基因在小鼠附睾头部1
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3区段特异表达，利用CRISPR/Cas9技术，在小鼠Lcn9基因的第六个外显子设计了gRNA的靶点：TTGCTTTTTATAGACCATAG；利用打靶载体将Cre的基因序列插入到Lcn9基因终止密码子之前，并将Cre基因序列和Lcn9基因序列通过2A序列连接；将得到的F0小鼠进行鉴定，Cre插入成功的F0代小鼠和WT小鼠繁殖生出F1代小鼠，通过PCR和测序的方法鉴定出Cre阳性的F1代小鼠。利用Cre阳性的F1代小鼠与Rosa26
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tdTomato小鼠杂交，我们发现红色荧光同Lcn9表达的部位一致，即表明Cre酶特异地表达于附睾头部1
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3区段。因此利用构建的Lcn9
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Cre小鼠与任意基因Flox小鼠交配即可获得该基因在附睾头部1
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3区段特异的敲除。附睾具有1
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10十个区段，现有的技术只能够利用Lcn5
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Cre在附睾4
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5区段特异的敲除基因，本专利技术建立了一种在小鼠附睾头部1
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3区段特异敲除基因的技术方法。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0014]图1是本专利技术实施例提供的特异敲除附睾头部基因的方法流程图。
[0015]图2是本专利技术实施例提供的Lcn9
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Cre小鼠构建原理图。
[0016]图3是本专利技术实施例提供的Lcn9
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Cre F1代小鼠测序鉴定示意图。
[0017]图4是本专利技术实施例提供的Lcn9区域特异性Cre小鼠的鉴定示意图。
具体实施方式
[0018]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0019]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种特异敲除附睾头部基因的方法，下面结合附图对本专利技术作详细的描述。
[0020]如图1所示，本专利技术提供的特异敲除附睾头部基因的方法包括以下步骤：
[0021]S101：在Lcn9的第六个外显子设计了gRNA的靶点：TTGCTTTTTATAGACCATAG；
[0022]S102：利用打靶载体将Cre的基因序列插入到Lcn9基因终止密码子之前，并将Cre序列和Lcn9的序列通过2A序列连接；
[0023]S103：将得到的F0小鼠进行鉴定，Cre插入成功的F0代小鼠和WT小鼠繁殖生出F1代小鼠，通过PCR和测序的方法鉴定出Cre阳性的F1代小鼠。
[0024]S104：利用Cre阳性的F1代小鼠与Rosa26
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tdTomato小鼠杂交，发现红色荧光同Lcn9表达的部位一致，即表明Cre酶特异地表达于附睾头部1
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3区段。因此Lcn9
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异敲除附睾头部基因的方法，其特征在于，所述特异敲除附睾头部基因的方法利用CRISPR/Cas9技术和打靶载体将Cre的基因序列插入到Lcn9基因终止密码子之前，并将Cre序列和Lcn9的序列通过2A序列连接，成功的制作了只在附睾头部特异表达Cre蛋白的Lcn9
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Cre，Lcn9
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Cre小鼠与任意基因Flox小鼠交配即可获得该基因在附睾头部1
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3区段特异的敲除。2.如权利要求1所述的特异敲除附睾头部基因的方法，其特征在于，所述特异敲除附睾头部基因的方法在Lcn9基因的第六个外显子设计了gRNA：TTGCTTTTTATAGACCATAG。3.如权利要求1所述的特异敲除附睾头部基因的方法，其特征在于，所述特异敲除附睾头部基因的方法将得到的F0小鼠进行鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建刚，温宗壮，孙晓阳，祝海霞，张爱珍，叶超，
申请(专利权)人：温宗壮，
类型：发明
国别省市：