一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，由设在盒体内的包被有RBD蛋白的微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、重组ACE2蛋白酶结合物、20

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及一种新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)中和抗体的检测，尤其涉及一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用，属于临床检验


技术介绍

[0002]由新冠病毒(SARS
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CoV
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2)引起的新冠肺炎(COVID
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19)大流行是一个世纪以来人类面临的最严峻挑战。新型冠状病毒即“SARS
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CoV
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2”感染后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。因其传染力、存活力很高，一年时间内全球感染总人数已接近9000万人。专家们普遍认为，在研发出一个安全有效的疫苗并成功实施全球疫苗接种计划以前，全社会都无法回到疫情前的正常状态。
[0003]研究表明，冠状病毒S蛋白是病毒毒力的关键因子，是决定病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分，也是中和抗体和疫苗设计的主要靶标。而评价疫苗接种后的效果，最直接的检测方法为新冠中和抗体的检测。因为，能识别新冠病毒的S(刺突)蛋白上的RBD区(受体结合域)的中和抗体，就可以阻断新冠病毒和人细胞上的ACE2受体结合，使得新冠病毒无法感染人细胞。此外，中和抗体可以与其他免疫成分——例如补体、吞噬细胞和自然杀伤细胞等——相互作用。这些效应反应都可以帮助清除病毒和被感染的细胞。中和抗体浓度越高，一般保护作用越好。因此，早期预测疫苗好坏的指标之一，就是看它能诱发人体内产生多少中和抗体。
[0004]传统的检测中和抗体的方法为活病毒或假病毒中和试验。试验方法需要专业细胞培养过程，对实验等级要求高，周期长、操作复杂，不适合普通接种疫苗人群高通量筛查。
[0005]中和抗体滴度可以反映出血液样品中抗体水平的指标，即接种疫苗后人体内免疫应答的好坏或强弱。随着新型冠状病毒疫苗的上市，对接种新冠疫苗人群和新冠感染后康复人群的中和抗体评价需要快速、可靠的、稳定、安全的评价方法。目前已有关于新型冠状病毒中和抗体酶联免疫的竞争抑制检测方法(CN202010919164.X、CN202010952237.5)，但上述公布的实验检测方法均属酶联免疫法竞争法和间接法，在实验操作中存在操作时间长(2
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3小时)的缺陷。因新冠病毒传染力很强，增加人工操作和反应时间，也相应增加了操作人员被感染的可能性。基于此，迫切需要开发了一种具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性好等特点的体外新冠中和抗体诊断试剂或检测试剂盒。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用。
[0007]本专利技术所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，由设在盒体内的包被有RBD蛋白的微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、重组ACE2蛋白酶结合物、20
×
浓缩洗涤液、显示液A、显示液B、终止液和说明书构成；
[0008]其特征在于：
[0009]所述微孔板为聚苯乙烯微孔板，且其各孔包被有浓度为5
‑
10μg/ml的重组RBD蛋白；
[0010]所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为2000ng/ml的RBD中和抗体溶液；
[0011]所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS
‑
CoV
‑
2抗体阴性血清；
[0012]所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX
‑
100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH 7.4；
[0013]所述重组ACE2蛋白酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组ACE2；该酶标ACE2酶结合物工作效价为1:5000，稀释液为酶结合物稀释液；
[0014]所述20
×
浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H
2 O 2.9g、吐温20 0.5mL；
[0015]所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述显示液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合；
[0016]所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
[0017]上述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒中，所述微孔板的包被方法是：
[0018]1.1)配制包被液：即配制碳酸盐缓冲溶液，并调整pH值为9.6；
[0019]Na2CO3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.59g
[0020]NaHCO3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.94g
[0021]纯化水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
定容至1000mL
[0022]过滤除菌，4℃保存；
[0023]1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
[0024][0025]过滤除菌，4℃保存；
[0026]1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
[0027][0028]过滤除菌，4℃保存；
[0029]1.4)用包被液将重组RBD蛋白稀释至工作浓度5
‑
10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
[0030]1.5)取标记好的微孔板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到150μL/孔，盖上盖板膜；
[0031]1.6)置于2℃
‑
8℃冰箱，包被4
‑
6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12
‑
16小时；
[0032]1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
[0033]1.8)每孔加入250μL封闭液，2℃
‑
8℃过夜封闭16小时；
[0034]1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
[0035]1.10)以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2
‑
8℃保存，备用。
[0036]上述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒中：所述RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS
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CoV
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2全长RBD的重组蛋白；所述ACE2蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，由设在盒体内的包被有RBD蛋白的微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、重组ACE2蛋白酶结合物、20
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浓缩洗涤液、显示液A、显示液B、终止液和说明书构成；其特征在于：所述微孔板为聚苯乙烯微孔板，且其各孔包被有浓度为5
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10μg/ml的重组RBD蛋白；所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为2000ng/ml的RBD中和抗体溶液；所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS
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CoV
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2抗体阴性血清；所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX
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100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH 7.4；所述重组ACE2蛋白酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组ACE2；该酶标ACE2酶结合物工作效价为1:5000，稀释液为酶结合物稀释液；所述20
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浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述显示液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合；所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，所述微孔板的包被方法是：1.1)配制包被液：即配制碳酸盐缓冲溶液，并调整pH值为9.6；Na2CO3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.59gNaHCO3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.94g纯化水
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定容至1000mL过滤除菌，4℃保存；1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：过滤除菌，4℃保存；1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；1.4)用包被液将重组RBD蛋白稀释至工作浓度5
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10μg/mL，混匀，并静置15分钟；1.5)取标记好的微孔板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到150μL/孔，盖上盖板膜；1.6)置于2℃
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8℃冰箱，包被4
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6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12
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16小时；1.7)取出包被板，室温平衡30...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵书平，欧兰香，陈振，张绍明，王岩，丁兴龙，
申请(专利权)人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：