用于有害生物防控的耐碱的磷酸钙/核酸混杂运载体及生产颗粒的方法技术

提供了用于有害生物防控的耐碱的磷酸钙/核酸混杂运载体及生产颗粒的方法。一种稳定的水性悬浮液包括含有纳米颗粒的组合物，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。所述纳米颗粒组合物和悬浮液具有高的核酸负载和高的稳定性，并且可以用于保护作物不受害虫侵害以及用于下调害虫物种中的靶基因的表达，从而防止和/或控制有害生物侵扰。制有害生物侵扰。制有害生物侵扰。

【技术实现步骤摘要】
用于有害生物防控的耐碱的磷酸钙/核酸混杂运载体及生产颗粒的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119要求2019年12月9日提交的系列号为62/945780的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。


[0003]本公开涉及用于将核酸递送到细胞或微生物中的组合物。具体地，本公开涉及将杀虫性RNA递送给有害生物和昆虫以保护植物和作物。

技术介绍

[0004]据估计，植物虫害和病原体使全球作物每年减产30％至40％。同时，已经使用了数十年并且被认为是目前控制有害生物种群的最佳选择的化学防控(即，使用杀虫剂)现在已被视为健康风险的潜在来源，因为它可能导致许多严重的健康影响和疾病，并且可持久地毒害环境。由化学杀虫剂的过度使用或滥用引起的第二个问题是有害生物对这些化学试剂产生的抗性。已知具有短世代时间的有害生物能更快得产生抗性，这使得杀虫剂迅速不可用。虽然已考虑使用表达杀虫蛋白的转基因植物，但部署转基因植物面临公众抵触，在某些国家可能不符合某些法规。因此，对保护作物的新方法的需求日益增长。
[0005]RNA干扰(RNAi)已被研究人员用于基因研究多年，但最近证明RNA干扰可用于使有害生物中的某些目标基因沉默。RNAi是19
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30个小的核酸RNA分子触发互补转录物的破坏或衰减的过程。基于RNAi的有害生物防控通过提供针对目标物种的高特异性来改进传统的小分子杀虫剂。这种生物学方法似乎很有吸引力，因为可以将特定的有害生物作为目标并控制其种群而不影响非目标物种，而使用化学杀虫剂是不可能实现的。例如，已经证明引入到蚊子幼虫中的dsRNA可以诱导雄性致育基因的RNAi介导的敲减。只需将适当的RNA喷在马铃薯植物的叶子上，即可以利用RNA干扰来控制科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)种群。
[0006]现在已经众所周知的是，如果RNA干扰是具有前景的选择，那么将RNA分子递送给昆虫的方法仍然是要解决的主要问题。理想情况下，需要通过简单的口服递送将RNA递送给有害生物，例如昆虫。然而，对于口服治疗，dsRNA必须挺过摄入，然后必须被上皮细胞吸收并迁移到适当的组织以激活RNAi机制。要解决的另一个重要问题是来自于RNA分子在环境中的低稳定性，RNA会被RNA酶迅速消化，并且在阳光下会发生自我裂解。RNA酶可能存在于目标昆虫的消化道中，也可能存在于环境中。
[0007]以前使用RNAi控制有害生物的一些尝试涉及将没有任何保护的裸RNA简单局部施用在植物表面上，例如叶片表面上，但是这种技术需要大量的核酸，因为它们中的大多数通常在不到一周的时间内在田间迅速降解，这使得该处理在经济上不可行。据估计，这种基于RNAi的处理必须持续至少一个月才能获得经济利益，但为此必须保护RNA免受外界侵害。
[0008]另一个问题是，当目标有害生物是昆虫时，一旦RNA到达目标有害生物，它必须抵抗在昆虫肠腔中观察到的恶劣环境。例如，鳞翅目(lepidopteran)的肠道可展现出10
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pH，这与烘炉清洁剂的pH值相当，而烘炉清洁剂会快速导致最具抵抗性的分子水解。另外，在消化道中存在许多核酸酶，它们也可以引起RNA的降解。针对RNA干扰表达感兴趣的RNA的酵母可作为天然载体用于喂养目标有害生物。然而，酵母是活生物体，这使得产品的使用和储存变得复杂。
[0009]保护RNA并改善其在目标生物体细胞内的递送的一种简单方法是在带负电荷的RNA和一些带正电荷的聚阳离子之间形成复合物。该复合物称为多聚复合物(polyplex)，其被广泛用于转染以用于治疗应用。在有效的聚阳离子中，源自天然生成的几丁质的合成PEI或壳聚糖以及含胍的聚合物被广泛用于该目的。为了更进一步改善对核酸酶的保护，提出使用聚合物，例如硫酸葡聚糖，已知其是核酸酶的有效抑制剂，因为大多数硫酸化聚阴离子是核酸酶抑制剂(参见例如第8,841,272B2号美国专利)。
[0010]最近，已经提出了用于将双链RNA递送至植物的粘土组合物，其保护植物免受多种生物的影响。在这种方法中，RNA被简单地吸附在层状双氢氧化物(LDH)粘土复合物上。该组合物可以是可以喷到植物上的悬浮液形式(参见，例如，第3116312号欧洲专利申请)。LDH是二价和三价金属的混合氢氧化物，具有过量正电荷，其被内部离子平衡，并且可以吸收带负电荷的核酸。尽管这样的核酸和无机载体的组合看起来很容易实施，但是适量的核酸递送可能不是那么有效。最近，在第10,405,539号美国专利中报告了对基于粘土的技术的改进，其通过在接触RNA之前，先用聚阳离子来预处理粘土颗粒来作为额外的步骤，以增加经过这样涂覆的粘土和带负电荷的核酸之间的静电相互作用来实现。当使用聚乙烯亚胺(PEI)预处理时，所报告的RNA在固体体系中的负载仅为1重量％。这样的RNA负载量不足以高到用于应用，特别是基于植物的应用。但是，通过用合成的阳离子聚合物聚(甲基丙烯酸2
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二甲基氨基乙基酯)(PDMAEMA)处理粘土，他们获得了高达25％的RNA负载。尽管这种改进的方法能够实现更高的RNA负载，但该方法需要使用合成聚合物涂覆的额外步骤。
[0011]这些结果显示在无机运载体的表面上吸收适当量的核酸仍然具有挑战性，并且很大程度上取决于所用的聚阳离子。
[0012]在20世纪70年代初，Graham和van der Eb(Virology；第2期，第52卷，1973年4月，第456
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467页)发现，DNA与通过氯化钙和磷酸盐缓冲液之间的反应所形成的磷酸钙共沉淀，并且当接触到细胞时，被细胞吸附。在过去的几十年中，该技术被广泛用于体外转染哺乳动物细胞，并且这种磷酸钙无机纳米颗粒被认为是用于基因治疗应用的具有前景的非病毒载体。然而，由Graham开发的技术需要使用大量过量的钙来增加细胞运输并因此促进纳米颗粒的内在化，从而促进核酸渗透到细胞质中。通常，在Graham的方案中，钙与磷酸盐的比值>200。
[0013]大量过量的钙离子增加了离子强度，这对静电稳定的悬浮液的稳定性具有有害作用。钙的这种过量导致得到不稳定的磷酸钙/核酸悬浮液，其经历快速聚集和不受控制的尺寸增加。产生的悬浮液絮凝并且不够稳定而无法贮存，实际上它们必须在制备后立即用于转染。因此，Graham和许多其他作者报道的依赖高的钙与磷比值的方法不能用于制备可以满足植物检疫组合物要求进行贮存的稳定悬浮液。在另一个实例中，M Jordan等人在“Transfecting mammalian cells:optimization of critical parameters affecting calcium
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phosphate precipitate formation(转染哺乳动物细胞：影响磷酸钙沉淀形成的关键参数的优化)”，96
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601Nucleic Acid本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其包括纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述核酸包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。3.如权利要求1所述的组合物，其还包括包盖剂，所述包盖剂至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述包盖剂包括聚阳离子。5.如权利要求3所述的组合物，其中，聚阳离子选自下组：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺、壳聚糖、寡肽、阳离子化多糖、阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白、鱼精蛋白、二乙基氨基乙基
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葡聚糖，聚酰胺型胺类、聚(β
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氨基酯)、氨基多糖、聚甲基吖丙啶、聚烯丙胺、聚乙烯胺均聚物或共聚物、聚(乙烯基吡啶)均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酰胺均聚物或共聚物及其衍生物。6.如权利要求3所述的组合物，其中，所述聚阳离子是聚乙烯亚胺。7.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒的峰值粒度小于500nm。8.如权利要求7所述的组合物，其中，纳米颗粒的峰值粒度在50nm至500nm的范围内。9.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸的重量比为100:1至1:1.5。10.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸与包盖剂的重量比为2:1:2至2:5:2。11.如权利要求1所述的组合物，其中，聚阳离子的带正电荷的氮原子数目与核酸的磷原子数目的比值大于1。12.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒悬浮在pH为6至11的水性分散体中。13.一种稳定的水性悬浮液，其包含如权利要求1所述的组合物。14.如权利要求13所述的稳定的水性悬浮液，其中，相对于纳米颗粒的总质量，核酸负载为约0.1重量％至约50重量％。15.如权利要求13所述的稳定的水性悬浮液，其中：(i)悬浮液中的磷酸钙浓度小于100μg/ml；或(ii)磷酸钙悬浮液中的钙与磷的摩尔比为1.5:1至5:1。16.如权利要求14所述的稳定的水性悬浮液，其还包括添加剂，所述添加剂选自下组：核酸酶抑制剂、表面活性剂、润湿剂、UV吸收剂、抗氧化剂、防冻剂、防腐剂、着色剂、杀虫剂、杀真菌剂、引诱剂、驱避剂和流变改性剂。17.一种保护作物免受害虫侵害的方法，所述方法包括给予作物如权利要求1所述的组合物。18.如权利要求17所述的方法，其中，所述组合物中的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：康宁股份有限公司，
类型：发明
国别省市：