一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法技术

本发明专利技术属于生物分析技术领域，公开了一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，使药物呈游离状态，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇

【技术实现步骤摘要】
一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法


[0001]本专利技术属于生物分析
，涉及一种血浆中吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone,PQQ)的液相色谱串联质谱检测方法。

技术介绍

[0002]吡咯喹啉醌是细菌脱氢酶氧化还原的辅助因子，被归类为维生素B家族的成员，广泛存在于多种微生物、植物中。人体和哺乳动物自身不能合成，通过饮食补充在体内多个组织中广泛分布。PQQ在哺乳动物中起着重要作用，包括防止肝脏、心脏和脑损伤，增强人成纤维细胞DNA的合成，促进神经生长因子的产生等。此外，它对由氢化可的松诱导造成胚胎性白内障具有防御作用并作为自由基清除剂；它还抑制淀粉样蛋白原纤维的形成并保护由C截短的α
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突触核蛋白变体的毒性的特性，使其成为预防帕金森氏病的有效药物。考虑到PQQ具有多种的生理作用，作为补充剂剂量设定，多个药效和毒理实验在给药后，只是从生化指标进行判断是否产生毒性，并未测定体内浓度，因此有必要开发一种测定体内PQQ浓度的简单高效检测方法。
[0003]Mizuho Fukuda采用以下方法测定人血浆中PQQ浓度：200μL血浆样品加200μL 1MNaH2PO4/HCl(pH＝2)酸化血浆，加300μL酸化后血浆到经活化的Varian Bond Elut C18固相萃取柱(依次用4mL甲醇和4mL水活化)，依次用2mL超纯水和600μL5％吡啶水溶液冲洗，最后用600μL 30％乙腈的水溶液洗脱并收集洗脱液，20μL洗脱液进样到液相色谱，从色谱柱洗脱后与0.15mM DTT和1.5mM鲁米诺混合在聚四氟乙烯管氧化还原反应，采用化学发光检测器进行浓度测定。水相为Tris
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HNO3缓冲液(50mM，pH8.8)添加4mM四丁基溴化铵离子对试剂，每个样品分析时间15min。
[0004]Takeshi Kumazawa采用以下方法测定人体和大鼠体内血浆和组织中PQQ浓度：在1g或1mL生物样品(血浆、组织)加入4mL 1M HCl、50μL2
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巯基乙醇、100μL 10％铁氰化钾、10mL正丁醇混匀后离心取上清；加入20mL正庚烷、1mL吡啶、0.1g NaCl、1mL蒸馏水，充分混匀离心取上清后挥干，用10mL0.1M HCl复溶，加入到Sep
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Pak C18 cartridge固相萃取柱中，用20mL 1mM HCl洗脱杂质，再用3mL 5％吡啶水溶液洗脱PQQ，挥干，用100μLPTMA氢氧化物复溶在100℃加热15min使其与PQQ充分甲基化，1μL进样到GC
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MS；使用
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C标记的PQQ作为内标物，测得线性范围在10
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250pg，检测线为0.1
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1.0ng/g，此种分析方法适合测定通过饮食补充所吸收的体内低PQQ浓度。
[0005]以上对于PQQ血浆样品提取方法包括固相萃取、衍生化、多次液液萃取，存在操作麻烦，耗时长，有机溶剂消耗较多，成本高、检测器不常用、分析时间长等缺点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过前处理简单有效的提取血浆中的PQQ，再在较短的测定时间内准确的检测血浆样品中的PQQ。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，使药物呈游离状态，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液或依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取，取上清液，氮气挥干溶剂，甲醇复溶，进样，采用液相色谱串联质谱(LC
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MS/MS)检测吡咯喹啉醌的浓度。
[0009]所述的强酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸，磷酸的浓度为4％(质量分数)，硝酸的浓度为0.8mol/L，盐酸的浓度为0.5mol/L，硫酸的浓度为0.25mol/L；优选为4％磷酸。
[0010]优选的，所述的酸化处理为：将大黄酸溶解在4％磷酸中作为内标物，采用与血浆等体积的4％磷酸酸化血浆，使血浆中大黄酸的终浓度范围为250
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500ng/mL，但是每批中所有样品保持大黄酸浓度一致。大黄酸的极性和分子量均与PQQ相似，符合内标物选择标准；大黄酸与PQQ采用相同酸化形式，不影响大黄酸检测；大黄酸提前加入到酸化剂中，与酸化剂同时加入血浆，简化操作步骤及减少误差，并实现未用
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C同位素标记PQQ作为内标物进行准确定量。
[0011]采用水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液进行液液萃取为：将酸化处理后的血浆和水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液混合，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶。其中，所述的水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液中水饱和正丁醇和乙酸乙酯的体积比为1:0.5
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1:1.5v/v，优选为1:1；所述的水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液和血浆的体积比为20:1。
[0012]依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取为：将酸化处理后的血浆和水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液混合，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶，再加入乙酸乙酯萃取，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶。其中，所述的水饱和正丁醇和血浆的体积比为20:1；所述的乙酸乙酯和血浆的体积比为20:1。
[0013]本专利技术中，离心的转速为18000rpm，离心的时间为5min。
[0014]液相色谱的条件为：WatersHSS T3column(50
×
3.0mm,2.5μm)色谱柱；柱温：40℃；流动相A：2
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10mM乙酸二丁基铵水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；梯度洗脱程序：0
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2min，20％B；2
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2.5min，20
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50％B；2.5
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4min，50％B；4
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4.5min，50
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20％B；4.5
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6min，20％B；进样体积：5μL。
[0015]优选的，流动相A：3mM乙酸二丁基铵水溶液，流动相B：乙腈。
[0016]质谱的参数为：离子源：电喷雾离子源，离子模式：负离子模式，监测模式：多反应监测。质谱检测器通过灵敏度高，进样量少，分析速度快，具有对PQQ和内标物特征离子分离和鉴定同时进行等优点实现体内微量PQQ药物浓度定量。
[0017]具体的，一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：取50μL血浆，采用与血浆等体积的含内标物大黄酸的4％磷酸对血浆进行酸化处理，采用20倍血浆体积水饱和正丁醇
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乙酸乙酯(1:1v/v)液液萃取，取800μL上清液，氮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱检测方法，其特征在于：包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液或依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取，取上清液，氮气挥干溶剂，甲醇复溶，进样，采用液相色谱串联质谱检测吡咯喹啉醌的浓度。2.根据权利要求1所述的血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱检测方法，其特征在于：所述的强酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸。3.根据权利要求1所述的血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱检测方法，其特征在于：所述的强酸为4％磷酸。4.根据权利要求1所述的血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱检测方法，其特征在于：所述的酸化处理为：将大黄酸溶解在4％磷酸中作为内标物，采用与血浆等体积的4％磷酸酸化血浆，使血浆中大黄酸的终浓度为250
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500ng/mL。5.根据权利要求1所述的血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱检测方法，其特征在于：采用水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液进行液液萃取为：将酸化处理后的血浆和水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液混合，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶；其中，所述的水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液中水饱和正丁醇和乙酸乙酯的体积比为1:0.5
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1:1.5v/v；所述的水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液和血浆的体积比为20:1。6.根据权利要求5所述的血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱检测方法，其特征在于：所述的水饱和正丁醇
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乙酸乙酯溶液中水饱和正丁醇和乙酸乙酯的体积比为1:1v/v。7.根据权利要求1所述的血浆中吡咯喹啉醌药物液相色谱质谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建国，王广基，吕明丽，彭英，倪赉一，甄乐，王庆庆，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：