一种椎间盘单细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开提供了一种椎间盘单细胞分离方法，包括：获得活体椎间盘组织样本，于生物洁净工作台去除混杂组织及血液，分离终板、纤维环和髓核，得到单一组织样本；将单一组织样本依次以胰蛋白酶、链霉蛋白酶、Ⅱ型胶原酶消化，得组织悬液；将组织悬液经过滤得细胞悬液，再离心弃上清后以红细胞裂解液重悬处理，然后再通过磁珠分选法或流式细胞分选法分选，即得单细胞样本。本发明专利技术提供的椎间盘单细胞分离方法首次采用高特异性酶消化及细胞分选策略，充分消化细胞外基质,高效去除消化残留杂质及细胞双倍体,在未经过体外扩增培养的条件下,获得代表椎间盘细胞体内真实表达及分布的、高纯度、高活力、满足单细胞测序建库标准的椎间盘单细胞原代(P0)代细胞。单细胞原代(P0)代细胞。单细胞原代(P0)代细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种椎间盘单细胞的分离方法

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[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种椎间盘单细胞的分离方法。

技术介绍
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[0002]椎间盘是两个相邻椎骨的椎体之间的软骨连接，由上下软骨终板、外围的纤维环和中心的髓核组成。腰腿痛是临床上高发的疾患之一。研究报道大多数患者腰腿痛均是由于椎间盘退变引起的，40岁以上人群中发病率高达40％
‑
70％，其相关诊疗费用对社会造成巨大的经济负担。目前的椎间盘退行性变的治疗策略，主要包括物理治疗、药物治疗、介入治疗、手术治疗等传统手段，仅可对症治疗，而无法改善椎间盘退变的病理进程，导致无法根除椎间盘退变的发生。最新研究发现，生物治疗策略是椎间盘退行性疾病具有前景的治疗手段，其中基于细胞治疗和组织工程的细胞移植技术目前最受关注，其治疗的重点是修复或替换退变的椎间盘组织，以重建椎间盘功能。然而，目前椎间盘生物治疗的进展，关键在于对椎间盘的生理与病理微环境认识缺乏了解，尤其是对椎间盘内的细胞异质性尚缺乏深入研究。
[0003]单细胞RNA测序(scRNA
‑
seq)技术是近年来得到快速发展的高通量测序技术，被认为是解决细胞异质性和解析复杂细胞生态位细胞成分的强大工具。单细胞RNA测序对细胞样本质量的要求极为严格，需具有高活性(≥80％)和高纯度(去除组织碎片和细胞粘连体等)等特殊要求，以确保单个细胞测序信息的准确性和可靠性。而传统技术分离椎间盘原代细胞的方法，由于酶的特异性较差，消化时间长，消化不彻底，导致细胞活力低下，产生的组织碎片和细胞粘连体较多，无法满足单细胞RNA测序的要求。亦有方法通过体外培养后获得P1代细胞，以提高细胞的活率和浓度,但是体外培养后细胞表型常常会产生较大改变,且丢失了不会贴壁、增殖活性较低的细胞亚群，无法代表椎间盘细胞在体内真实表达及分布情况,因此也不适用于单细胞测序。
[0004]因此亟需研发一种适用于单细胞RNA测序样本需求的高活性与高纯度椎间盘原代(P0)代细胞的分离方法，所分离的椎间盘细胞可反映体内的真实表达及分布情况，为后续椎间盘的细胞异质性研究提供优质的细胞标本。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的在于提供一种椎间盘单细胞样品的分离方法，包括：
[0006]1)获得活体椎间盘组织样本，于生物洁净工作台以含青链霉素的PBS洗净组织至无肉眼可见血液沾染，然后，分离终板、纤维环和髓核，并分别保存，得到单一组织样本；
[0007]2)将单一组织样本分别充分剪碎，以含青链霉素的PBS重悬，离心，弃上清，得第一沉淀；
[0008]3)将所述第一沉淀与0.25％胰蛋白酶溶液混合，于37℃消化30分钟，消化后离心，弃上清，得第二沉淀；
[0009]4)将所述第二沉淀与0.2％链酶蛋白酶溶液混合，于37℃消化60分钟，消化后离
心，弃上清，得第三沉淀；
[0010]5)将所述第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液混合，于37℃消化至组织消化完全，得组织悬液；
[0011]6)将所述组织悬液经40μm细胞滤网过滤，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液离心，弃上清，得第四沉淀；
[0012]7)将所述第四沉淀以红细胞裂解液重悬细胞，室温下静置5分钟，然后再加入2mL含青链霉素的PBS，离心，弃上清，得第五沉淀；
[0013]8)将所述第五沉淀通过磁珠分选法或流式细胞分选仪法获取细胞，即得单细胞样本。
[0014]本专利技术提供的椎间盘单细胞分离法可提高细胞分离活率和纯度，相较于传统的一步消化法(0.2％II型胶原酶2
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4h)，椎间盘单细胞分离法由于高特异性酶消化及细胞分选策略，充分消化细胞外基质,高效去除消化残留杂质及细胞双倍体,获得高纯度、高活力、满足单细胞测序建库标准的椎间盘单细胞悬液(图3A和3C)。
[0015]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述含青链霉素的PBS为含2％青链霉素的PBS。
[0016]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤5)中若单一组织样本为髓核组织时，Ⅱ型胶原酶溶液的浓度为0.1％；若单一组织样本为终板或纤维环时，Ⅱ型胶原酶溶液的浓度为0.2％。
[0017]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)、3)、4)、5)、6)或7)中的离心条件为4℃、300g离心5min。
[0018]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)中所述充分剪碎是通过圆剪和眼科剪将所述单一组织样本剪碎至1mm3大小。
[0019]在根据本专利技术的一个实施方案中，
[0020]步骤3)中，以g:ml计第一沉淀与胰蛋白酶溶液的比例为1：5；
[0021]步骤4)中，以g:ml计第二沉淀与链酶蛋白酶溶液的比例为1：5；
[0022]步骤5)中，以g:ml计第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液的比例为1：5。
[0023]在根据本专利技术的一个实施方案中，
[0024]步骤8)在分选前还包括，吸取适量所述重悬细胞悬液以AO/PI溶液染色计数；
[0025]优选地，所述重悬细胞悬液与AO/PI溶液以1:1体积比混匀后立即计数；优选地，所述计数是利用Counter Star计数仪实现的。
[0026]AO/PI细胞荧光死活染色法可准确判断细胞样品质量，相较于传统的台盼蓝细胞活率染色，不会产生非特异性染色,运用Countstar Rigel S1细胞计数仪的AO/PI细胞荧光死活染色功能，可以更加准确判断人椎间盘原代(P0)代细胞的活率。
[0027]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述磁珠分选法包括：
[0028]a)以适量Dead Cell Removal Micro Beads重悬细胞，轻柔混匀后室温孵育15分钟；
[0029]b)将MACS Separator分离器吸附于MACS MultiStand支架，并将MS柱吸附于分离器上，并以1
×
Binding Buffer进行润洗；
[0030]c)向孵育好的细胞中加入适量1
×
Binding Buffer，轻柔混匀，转移至MS柱悬空滴加，活细胞靠重力过柱；
[0031]d)待MS柱中液体即将滴完时再悬空加入1
×
Binding Buffer冲洗数次，离心，弃上清，用适当体积的PBS+0.04％BSA重悬细胞。
[0032]利用磁珠分选法去除死细胞可以有效提高细胞活率,减少细胞杂质，相比于磁珠分选前，磁珠分选可以有效减少人类椎间盘原代细胞杂质，降低细胞结团率，提高细胞活率，使细胞样本更加符合单细胞测序的要求。
[0033]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述流式细胞分选仪法包括：
[0034]Ⅰ)以含有3％BSA的PBS重悬细胞，以7
‑
AAD染色后，离心、弃上清，并以PBS重悬细胞，然后以流式过滤管过滤；
[0035]Ⅱ)启动流式细胞分选仪，在流式细胞仪分析软件中依次进行以下操作：
[0036]创建F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，包括：1)获得活体椎间盘组织样本，于生物洁净工作台以含青链霉素的PBS洗净组织至无肉眼可见血液沾染，然后，分离终板、纤维环和髓核，并分别保存，得到单一组织样本；2)将单一组织样本分别充分剪碎，以含青链霉素的PBS重悬，离心，弃上清，得第一沉淀；3)将所述第一沉淀与0.25％胰蛋白酶溶液混合，于37℃消化30分钟，消化后离心，弃上清，得第二沉淀；4)将所述第二沉淀与0.2％链酶蛋白酶溶液混合，于37℃消化60分钟，消化后离心，弃上清，得第三沉淀；5)将所述第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液混合，于37℃消化至组织消化完全，得组织悬液；6)将所述组织悬液经40μm细胞滤网过滤，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液离心，弃上清，得第四沉淀；7)将所述第四沉淀以红细胞裂解液重悬细胞，室温下静置5分钟，然后再加入2mL含青链霉素的PBS，离心，弃上清，得第五沉淀；8)将所述第五沉淀通过磁珠分选法或流式细胞分选仪法获取细胞，即得单细胞样本。2.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，所述含青链霉素的PBS为含2％青链霉素的无Ca
2+
Mg
2+
PBS。3.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤5)中若单一组织样本为髓核组织时，Ⅱ型胶原酶溶液的浓度为0.1％；若单一组织样本为终板或纤维环时，Ⅱ型胶原酶溶液的浓度为0.2％。4.如权利要求1所述的人类椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤2)、3)、4)、5)、6)和7)中的离心条件为4℃、300g离心5min。5.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤2)中所述充分剪碎是通过圆剪和眼科剪将所述单一组织样本剪碎至1mm3大小。6.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤3)中，以g:ml计第一沉淀与胰蛋白酶溶液的比例为1：5；步骤4)中，以g:ml计第二沉淀与链酶蛋白酶溶液的比例为1：5；步骤5)中，以g:ml计第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液的比例为1：5。7.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤8)在分选前还包括，吸取适量所述重悬细胞悬液以AO/PI溶液染色计数；优选地，所述重悬细胞悬液与AO/PI溶液以1:1体积比混匀后立即计数；优选地，所述计数是利用Counter Star计数仪...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘翼搏，刘鹏，朱军，胡欧，王钟，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：