一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN‑α生物学活性的方法，属于蛋白活性检测技术领域。本发明专利技术将犬ISRE启动子片段插入带有绿色荧光蛋白的质粒中，构建表达绿色荧光蛋白的重组质粒，通过检测绿色荧光蛋白的表达情况来判断ISRE启动子的激活情况，从而检测犬α‑IFN生物学活性。本发明专利技术利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬α‑IFN生物学活性的方法与传统检测方法MDCK‑VSV相比，避免了VSV病毒感染人的风险，提高了生物安全性。本发明专利技术操作简单，可重复性高，成本低，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法
本专利技术属于蛋白活性检测
，特别涉及一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法。
技术介绍
随着人民的生活水平逐渐提高，伴侣动物的需求量越来越大，随之犬类病毒性疾病对伴侣动物的危害也越来越大，常见的有犬细小病毒病，犬瘟热、犬传染性肝炎等疾病严重危害犬的生命健康；还有狂犬病、钩端螺旋体等人畜共患病对人类的安全存在极大的威胁。在兽医临床上主要以干扰素作为犬病毒性疾病治疗的首选制剂。干扰素是一种信号蛋白，根据其特异性受体结合可分为三大类：I型(IFNα/β)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。I型干扰素在先天性免疫中起着抗病毒、抗增殖和免疫调节等功能。IFN-I途径是通过检测感染因子的典型结构元素而启动的，这种结构元素可以被特定识别受体识别。病毒复制过程中产生的RNA可被受体检测，这些受体与病毒RNA结合后，招募特异性受体蛋白，诱导IFN-I的转录。IFN-I以自分泌或旁分泌的方式与特异性受体结合，从而触发抑制病毒复制的信号通路。受体相关激酶Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸激酶1(TYK2)磷酸化转录因子STAT1和STAT2，然后与IRF9结合形成异源三聚体复合物，成为干扰素刺激基因因子3(ISGF3)。转移到细胞核后，ISGF3诱导许多IFN刺激基因(ISG)的转录，这里基因的启动子位置有一个IFN刺激反应元件(ISRE)。ISGs包括MX蛋白、2′-5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)、PKR等可抑制病毒转录，翻译和释放的细胞因子。因此，干扰素已被广泛用于治疗病毒性疾病和增殖性疾病。目前有关制备犬α干扰素的研究较多，但针对如何检测犬α干扰素的活性仍缺少标准的检测方法。现干扰素生物学活性的检测主要采用以下方法检测：1、细胞病变抑制法。此方法存在一定的局限性，根据细胞的形态变化判断结果，费时耗力，主观误差较大，且结果只对活细胞染色，特异性和灵敏度较低。传统方法检测犬干扰素时一般采用MDCK-VSV系统，VSV病毒本身存在危险性，会导致猪、牛和人等哺乳动物共感染。2、荧光素酶报告基因法。此法受到多种因素的影响，同一批样品的检测值也会出现浮动，且要避免荧光素酶衰变的影响以及萤火虫荧光素酶发光半衰期的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，包括如下步骤：S1:将犬ISRE蛋白的启动子克隆在绿色荧光蛋白基因上游，构建成绿色荧光蛋白报告质粒；S2:将重组质粒转染体外培养的细胞；S3:用犬IFN-α刺激转染后的细胞，通过检测绿色荧光蛋白的表达量，判断犬ISRE蛋白的启动子的激活情况，从而检测犬IFN-α的生物学活性。犬IFN-α是I型干扰素家族结构中相关的细胞因子，介导病毒感染后的早期天然免疫应答。在犬基因组中有不同的IFN-α基因，这些基因通过模式识别受体，如维甲酸诱导基因I(RIG-I)解旋酶，在病毒感染的细胞中被转录激活。通过与IFNα/β受体结合，激活JAK-STAT信号转导途径并表达一些具有较强抗病毒活性的蛋白，如Mx蛋白、蛋白激酶等。因此当激活ISGs启动子ISRE，就能够直接反映出犬α干扰素的生物学活性。步骤S1中，所述犬ISRE蛋白的启动子的核苷酸序列如下所示(亦如SEQIDNO.1所示)：TGAGCTCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCTAGTTTCATTTCCCCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCA。步骤S1中，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如下所示(亦如SEQIDNO.2所示)：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG。优选的，步骤S1中，所述绿色荧光蛋白报告质粒通过如下方法构建得到：(1)委托公司合成所述犬ISRE蛋白的启动子片段，用引物ISRE-F和ISRE-R通过PCR将启动子片段的两端加上酶切位点KnpI和NcoI；将纯化的PCR产物用KnpI和NcoI双酶切，再与经同样双酶切的载体pGL3-Basic连接，获得重组质粒pGL3-Basic-ISRE；(2)将步骤(1)所得重组质粒pGL3-Basic-ISRE用NcoI和XbaI双酶切去除载体中Luciferase片段，获得线性片段；(3)委托公司合成所述绿色荧光蛋白基因片段，用引物EGFP-F和EGFP-R通过PCR将启动子片段的两端加上酶切位点NcoI和XbaI；将纯化的PCR产物用NcoI和XbaI双酶切，再与步骤(2)所得线性片段连接，获得重组质粒pGL3-ISRE-EGFP，即为所述的绿色荧光蛋白报告质粒；其中，所述引物ISRE-F和ISRE-R的序列分别为：ISRE-F：GGGGTACCTGAGCTCTAGTTTC；ISRE-R：GCCCATGGTGGCTTTACCAACA；所述引物EGFP-F和EGFP-R的序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1:将犬ISRE蛋白的启动子克隆在绿色荧光蛋白基因上游，构建成绿色荧光蛋白报告质粒；/nS2:将重组质粒转染体外培养的细胞；/nS3:用犬IFN-α刺激转染后的细胞，通过检测绿色荧光蛋白的表达量，判断犬ISRE蛋白的启动子的激活情况，从而检测IFN-α的生物学活性；/n步骤S1中，所述犬ISRE蛋白的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1:将犬ISRE蛋白的启动子克隆在绿色荧光蛋白基因上游，构建成绿色荧光蛋白报告质粒；
S2:将重组质粒转染体外培养的细胞；
S3:用犬IFN-α刺激转染后的细胞，通过检测绿色荧光蛋白的表达量，判断犬ISRE蛋白的启动子的激活情况，从而检测IFN-α的生物学活性；
步骤S1中，所述犬ISRE蛋白的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1中，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S3中，所述犬ISRE蛋白的启动子的激活情况的判断方法为：观察绿色荧光蛋白的表达情况，若有明显绿色荧光蛋白表达，即犬α干扰素蛋白组和空白对照组相比，绿色荧光蛋白差异较显著，便将其消化为单个细胞，并通过流式细胞术来定量分析绿色荧光蛋白的表达量，以此判断ISRE启动子的激活情况。


4.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S2中，所述体外培养的细胞为犬细胞。


5.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S2中，所述体外培养的细胞为犬肾细胞MDCK。


6.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S2中，所述体外培养的条件为：37℃、5％CO2、95％湿度的环境中培养20-30h。


7.根据权利要求1所述的利用绿色荧光蛋白报告基因检测犬IFN-α生物学活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1中，所述绿色荧光蛋白报告质粒通过如下方法构建得到：
(1)委托公司合成所述犬ISRE蛋白的启动子片段，用引物ISRE-F和ISRE-R通过PCR将启动子片段的两端加上酶切位点KnpI和NcoI；将纯化的PCR产物用Knp...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖明，潘志超，冯赛祥，王晓冰，余慧雯，许斯祺，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44