一种生物传感器联合蛋白免疫反应在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生物传感器联合蛋白免疫反应在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，其特征在于，包括AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器和蛋白免疫反应；通过构建的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，开展五味子甲素治疗少弱精子症信号通路体外检测实验，进一步联合蛋白免疫反应，开展五味子甲素治疗少弱精子症信号体内通路检测实验，发现五味子甲素是通过调节SCF/c‑kit通路发挥治疗少、弱精子症的作用；该检测方法特异性强，检测浓度低至pg/pM级，检测范围涵盖五个数量级，具有高灵敏度和强专属性。

【技术实现步骤摘要】
一种生物传感器联合蛋白免疫反应在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用
本专利技术涉及中药领域，具体涉及一种生物传感器联合蛋白免疫反应在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用。
技术介绍
研究表明全世界大约5％的异性夫妇有不孕的问题。然而，更多的夫妇经历了至少一年的非自愿无子女：估计在12％到28％之间。男性不孕症占不孕症病例的20％-30％，据调查发现，近年来男性不育的发生率显著增高，最常见的原因是精液缺乏，其中由少、弱精子症导致的男性不育症高达60％，严重影响人们的家庭和谐和生活质量，是全球亟待攻克的关键难题。针对少、弱精子症，现代医学虽开展了大量研究，但目前尚缺乏疗效确切的治疗药物。中医药基于整体观和辨证论治思想治疗男性不育症历史悠久，疗效确切。中医男科学奠基人之一王琦院士提出少、弱精子症的核心病机为“肾虚挟湿热瘀毒虫”，并根据此病机提出了“补肾益精、清热利湿、活血化瘀”的治疗原则，基于此创研了我国第一个专门治疗男性不育症的生精方药“黄精赞育胶囊”。临床结果显示，该药能增加精子数量，提高精子活力，对于少、弱精子症引起的男性不育症疗效显著。前期研究表明，其有效成分五味子甲素具有提高精子活力的作用，有望开发低毒高效的生精药物，但其作用机制仍待进一步研究。目前常用于检测信号通路的方法为蛋白免疫反应方法，但是单独使用该方法缺乏对作用机制的直观表征。高电子迁移率晶体管(HighElectronMobilityTransistor,HEMT)作为第三代电化学型器件，以其更高的灵敏度和更强的专属性为分子间相互作用机制的识别提供了关键的前沿技术支撑。然而，联合生物传感器技术和蛋白免疫反应方法用于检测五味子甲素提高少、弱精子症样本精子活力的作用机制的研究仍为空白。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对单独体外实验缺乏可靠性，单独体内实验缺乏作用机制的直观表征问题，提供一种结合高灵敏度和强专属性的HEMT生物传感器的体外实验联合基于蛋白免疫反应方法的体内验证实验方法，解析五味子甲素提高少、弱精子症样本精子活力的作用机制。本专利技术提供一种AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，首先提供一种AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中应用，具体技术方案如下：(1)构建c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器和SCF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，具体制备步骤如下：a将干净的AlGaAs/GaAsHEMT器件置于巯基试剂中，于室温下浸泡24小时，在AlGaAs/GaAsHEMT器件表面生成Au-S键，生成自组装单层；b.用去离子水洗去AlGaAs/GaAsHEMT器件表面的巯基试剂，加入碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液，反应15分钟，生成稳定的胺类活化产物以活化羧基；c.用PBS清洗AlGaAs/GaAsHEMT器件，加入络氨酸激酶(c-kit)或重组人干细胞因子(SCF)，于4℃下反应2小时，即得c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器或SCF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器；(2)基于AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器的五味子甲素治疗少弱精子症通路的检测方法，具体检测步骤如下：a.制备c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，由低到高依次加入浓度范围的重组人干细胞因子SCF的PBS溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS；以SCF蛋白溶液浓度的对数Lg为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，确定c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器用于检测SCF蛋白溶液的浓度范围；以SCF蛋白溶液的浓度为横坐标，以(2)中确定浓度范围的浓度/电流变化为纵坐标，进行线性拟合，求得SCF与c-kit相互作用的解离常数；b.制备c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，向传感器中依次加入浓度由低到高的五味子甲素标准品溶液(浓度范围为0.1pM-1.0mM)，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS；以五味子甲素标准品溶液浓度的对数为横坐标，以电流变化相对值为纵坐标，进行线性拟合，确定五味子甲素标准品溶液浓度的检测范围；以五味子甲素标准品溶液的浓度为横坐标，以确定检测范围的浓度/电流变化为纵坐标，进行线性拟合，根据公式计算五味子甲素与c-kit相互作用强度；c.制备SCF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，按b同法分析五味子甲素与SCF相互作用情况；d.制备c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，依次加入浓度由低到高的重组人干细胞因子SCF和五味子甲素的混合溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS，考察五味子甲素对SCF/c-kit相互作用的影响。本专利技术进一步提供一种蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中应用，具体步骤如下：(1)构建少、弱精子症动物模型，分空白对照组，五味子甲素高中低三个剂量组和左卡尼汀组给药，所有大鼠最后一次给药后，取静脉血后处死动物，取睾丸组织冻存；(2)取睾丸组织制成石蜡切片，结合免疫化学反应方法，观察睾丸组织中SCF和c-kit蛋白表达情况；(3)切取睾丸组织，剪碎，加入PBS缓冲液，于4℃离心，弃去上清液，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解睾丸组织，4℃离心取上清液备用；以牛血清白蛋白溶液为标准液，采用酶标仪测定SCF抗体和c-kit抗体的蛋白浓度，调整样本浓度，水浴加热使蛋白充分变性；(4)采用电泳分离蛋白，通过制胶、电泳、转膜、染膜及封闭等步骤，制备PVDF膜，加入SCF和c-kit二抗溶液反应，通过westernblot反应，结合数码凝胶图像分析系统分析蛋白含量；(5)结合组织切片结果和westernblot结果，分析五味子甲素介导SCF/c-kit通路治疗少弱精子症的机制。有益结果：本专利技术提供的一种AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，首先采用自主研发的AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器开展了体外五味子甲素治疗少弱精子症信号通路的检测实验，发现五味子甲素能够通过作用于SCF/c-kit通路，检测范围达到pg/pM级，专属性强，灵敏度高，在体外直观反映出五味子甲素与SCF/c-kit通路中蛋白的相互作用；进一步，构建了少弱精子症大鼠模型，并采用蛋白免疫反应方法，开展了五味子甲素治疗少弱精子症信号通路的体内验证实验，结果表明五味子甲素确实能够改善少弱精子症动物模型的睾丸组织结构，提高睾丸组织中SCF蛋白的含量，同时降低c-kit蛋白的含量。基于AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器的五味子甲素治疗少弱精子症信号通路体外检测实验和基于蛋白免疫反应的五味子甲素治疗少弱精子症信号通路本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，其特征在于，包括AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器和蛋白免疫反应，治疗的信号通路包括SCF/c-kit通路。/n

【技术特征摘要】
1.一种AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，其特征在于，包括AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器和蛋白免疫反应，治疗的信号通路包括SCF/c-kit通路。


2.根据权利要求1中所述的一种AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，其特征在于，AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中应用的具体步骤如下：
(1)AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器的制备：
a.将干净的AlGaAs/GaAsHEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAsHEMT器件表面生成Au-S键，生成自组装单层；
b.用去离子水洗去AlGaAs/GaAsHEMT器件表面的巯基试剂，加入羧基活化剂，生成稳定的胺类活化产物；
c.用磷酸盐缓冲液清洗AlGaAs/GaAsHEMT器件，加入络氨酸激酶c-kit或重组人干细胞因子SCF，反应完成，即得c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器或SCF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器；
(2)AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器在黄精赞育胶囊有效成分治疗少、弱精子症信号通路检测中的应用：
a.根据(1)所述方法制备c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，依次加入浓度由低到高的重组人干细胞因子SCF溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度；以SCF蛋白溶液浓度的对数为横坐标，以电流变化相对值为纵坐标，进行线性拟合，进一步根据公式计算SCF与c-kit相互作用强度；
b.根据(1)所述方法制备c-kit-AlGaAs/GaAsHEMT和SCF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器，分别向两个传感器中依次加入浓度由低到高的五味子甲素标准品溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度；以五味子甲素标准品溶液浓度的对数为横坐标，以电流变化相对值为纵...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志生，郑燕飞，马丽娟，李博怿，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：北京;11