本发明专利技术公开了一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法及试剂盒，属于胆汁酸检测技术领域。本发明专利技术公开的一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，先对样本进行前处理，再进入色谱分离及质谱检测，针对每种胆汁酸分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种胆汁酸的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本发明专利技术方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。本发明专利技术首次实现了应用LC‑MS技术对一份血清样本中的十五种胆汁酸同时检测的目的，减小了干扰物影响，该方法操作简便快速，有效监测人体内胆汁酸水平，对胆汁酸的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法及试剂盒
本专利技术涉及胆汁酸检测
，更具体的说是涉及一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法及试剂盒。
技术介绍
胆汁酸由胆固醇代谢产生，根据合成途径，可以分为由胆固醇为原料直接合成的初级胆汁酸和代谢产生的次级胆汁酸。胆汁酸是胆汁的重要组成成分，是人体脂肪代谢的必须物质。胆汁酸不仅能够调节葡萄糖和脂肪代谢，还能与肠道菌群相互作用，具有重要的临床意义。现有检测方法只能简单地定量测量总胆汁酸水平，不能定量检测每一种亚型的胆汁酸在体内的水平。现有技术中，常用的胆汁酸检测方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱-质谱联用法，以及液相色谱-串联质谱法等。但是目前对于检测人体血清中胆汁酸亚型的研究相对较少，方法通量较低，也缺乏健康人参考范围。因此，提供一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法及试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法及试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，采用LC-MS检测血液样品中多种胆汁酸；色谱条件：色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3，1.8μm，2.1×100mm，柱温：30℃；流动相A：5mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件：0-1.2min30-35％B,1.2-2min35％B,2-3min35-41％B,3-4min41-45％B,4-4.5min45％B,4.5-5.3min45％B,5.3-5.5min45-80％B,5.5-7.5min80％B,7.5-8.7min80-35％B,8.7-9.2min35％B,9.2-10.5min35％B，流速0.4mL/min，进样量1μL；质谱条件：采用ESI源，MRM正负离子扫描模式，雾化气流量为3L/min，加热气流量为13L/min，接口温度为350℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，干燥气流量为7L/min。梯度洗脱条件：MRM质谱参数如下：进一步，所述血液样品为血浆或血清。进一步，所述多种胆汁酸为牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸中的至少两种。优选地，所述多种胆汁酸为牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸。进一步，一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，具体步骤如下：(1)待测样本处理：取样本涡旋30s后，取400μl悬浮液样本于1.5mlEp管中，4℃以13000rpm离心15min；取上清液100μL，置于1.5mLEp管，加入100μL甲醇稀释；加入1μLN-1-萘基酞氨酸内标溶液混匀后用0.22μm微孔滤膜过滤，将全部样品转移至96孔板中，覆上铝箔封膜，检测备用；(2)标准溶液配制：标准品(牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸)均用甲醇溶解，配制成单标母液浓度为5mM的标准品，分别取各单标母液等量混合成浓度为0.33mM的混合储备液，用甲醇稀释系列浓度；(3)内标溶液配制：内标用甲醇稀释，配制成浓度为0.033mM的内标储备液；(4)LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，对待测物质进行定性与定量检测。进一步，一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的试剂盒，包括如下组分：标准溶液，内标溶液，甲醇，乙腈，5mM乙酸铵溶液，质控品；所述多种胆汁酸为牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸中的至少两种。进一步，标准溶液为由标准品(牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸中的至少两种)等量混合成的浓度为0.33mM的混合储备液。进一步，内标溶液为浓度0.033mM的N-1-萘基酞氨酸溶液。进一步，所述的试剂盒在同时检测牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸中的应用。质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工血清添加混合胆汁酸标准物质制得，并通过检测确定靶值。应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应胆汁酸峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中十五种胆汁酸的浓度。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法及试剂盒，对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件进行了优化；进而提供一种同时测定血清中牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸的方法。采用本专利技术可以同时检测人血清中十五种胆汁酸牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。本专利技术使用的样本处理方法，可以较多地去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作简单快捷，可以灵敏地检测出各种胆汁酸的含量。本专利技术可以同时检测十五种胆汁酸，一是降低了检测成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以对多种胆汁酸的补充提供依据。本专利技术用超高效液相色谱-质谱法检测血清中十五种胆汁酸，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法的试剂盒对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要意义。本专利技术方法针对每种胆汁酸分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种胆汁酸的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本专利技术方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。本专利技术首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中的十五种胆汁酸同时检测的目的，用两对离子分别进行定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，其特征在于，采用LC-MS检测血液样品中多种胆汁酸；色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITYUPLC HSS T3，1.8μm，2.1×100mm，柱温：30℃；流动相A：5mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件：0-1.2min 30-35％B,1.2-2min 35％B,2-3min35-41％B,3-4min 41-45％B,4-4.5min 45％B,4.5-5.3min 45％B,5.3-5.5min45-80％B,5.5-7.5min 80％B,7.5-8.7min 80-35％B,8.7-9.2min 35％B,9.2-10.5min 35％B，流速0.4mL/min，进样量1μL；质谱条件：采用ESI源，MRM正负离子扫描模式，雾化气流量为3L/min，加热气流量为13L/min，接口温度为350℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，干燥气流量为7L/min。/n
【技术特征摘要】
1.一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，其特征在于，采用LC-MS检测血液样品中多种胆汁酸；色谱条件：色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3，1.8μm，2.1×100mm，柱温：30℃；流动相A：5mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件：0-1.2min30-35％B,1.2-2min35％B,2-3min35-41％B,3-4min41-45％B,4-4.5min45％B,4.5-5.3min45％B,5.3-5.5min45-80％B,5.5-7.5min80％B,7.5-8.7min80-35％B,8.7-9.2min35％B,9.2-10.5min35％B，流速0.4mL/min，进样量1μL；质谱条件：采用ESI源，MRM正负离子扫描模式，雾化气流量为3L/min，加热气流量为13L/min，接口温度为350℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，干燥气流量为7L/min。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，其特征在于，所述血液样品为血浆或血清。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，其特征在于，所述多种胆汁酸为牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨胆酸、胆酸、石胆酸、牛磺胆酸和牛磺石胆酸中的至少两种。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测血液样品中多种胆汁酸的方法，其特征在于，所述多种胆汁酸为牛磺熊去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧...
【专利技术属性】
技术研发人员：张召，刁嘉茵，郑康帝，陈涛，
申请(专利权)人：广东南芯医疗科技有限公司，佛山市朗芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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