观察活细胞细胞膜表面及附近生物大分子的荧光成像方法技术

本发明专利技术提供一种观察活细胞细胞膜表面及附近生物大分子的荧光成像方法。其基于荧光共振能量转移原理,使用全内反射或者共聚焦照明的照明方式对所述大分子在细胞膜径向位移进行测量。所述方法包括特定荧光供体受体的配对规则，对活体细胞的荧光标记方案以及对测定数据的计算过程。本发明专利技术能够以较高时间和空间分辨率在亚纳米尺度观察细胞膜及细胞膜附近生物分子的运动状态与构象变化，同时不破坏细胞膜，能够保持对活体细胞的观测，其次本发明专利技术能够高通量快速地完成膜受体相关药物的筛选。

【技术实现步骤摘要】
观察活细胞细胞膜表面及附近生物大分子的荧光成像方法
本专利技术涉及用荧光成像方法观察生物大分子的
，具体地说，本专利技术涉及一种原位观察活细胞的细胞膜内及细胞膜表面的大分子构象及位置变化的荧光成像方法。
技术介绍
细胞膜是将细胞与外界环境分割开的选择透过性屏障，它控制着信息的流动和物质的进出，膜蛋白是很多药物的靶标。推进膜相关过程的研究依赖于能够测量膜中生物分子位置和构象变化的新技术。大多数膜相关过程发生在细胞膜内(插膜)或膜附近十纳米范围内。现有技术通常使用荧光方法原位观察活细胞内生物分子构象变化与运动，步骤包括：1)将正常状态的细胞培养并接种到培养皿、多孔板或微流体孔道中；2)对细胞内的目标生物分子进行荧光标记(在细胞体外荧光标记之后将荧光分子导入体内或细胞内原位表达并标记荧光)；3)使用全内反射荧光显微镜，赝全内反射荧光显微镜，共聚焦显微技术，落射荧光显微镜、结构光照明显微镜或受激发射损耗荧光显微技术等荧光观察方法观察细胞内荧光标记分子。由于光的衍射效应的存在，可见光范围内的荧光显微镜x、y方向分辨率只能达到约250纳米，z方向分辨率约为900纳米。即使使用更精确的结构光照明或STED显微技术观察细胞，也只能将荧光显微镜的分辨率提高到几十纳米。然而，细胞膜的厚度仅为4.5纳米左右，原位观察活细胞膜及其周围纳米范围的分子运动十分困难。现有技术中已知的荧光共振能量转移(FRET)是一种高精度的光谱尺，是解决光学显微镜衍射极限的方法之一，可以用来探测亚纳米级别的供体的运动，荧光共振能量转移指的是当两个荧光基团离得足够近时，只激发其中一个荧光基团A，另一个荧光基团B会接收到非辐射能量，从A的荧光强度可以判断A、B两个荧光基团的间距，其空间分辨率可以达到纳米量级。但荧光共振能量转移方法要求受体的位置完全已知，只能用来简单的观察两个分子之间点对点的距离，这在流动的活细胞膜上很难实现，在膜体系中，由于膜存在流动性，膜上的分子沿着膜表面的切向会不断扩散运动，而真正与膜功能相关的分子运动是沿着膜的法向(即径向)的，在这种情况下常规的FRET方法无法有效得出该分子距离膜表面法向距离的变化。现有技术中的电子显微镜具有较高分辨率，但是其通常只能在低温或真空环境观察固定的细胞样品，所以无法对活体细胞直接进行观测。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种原位观察活细胞膜及其附近生物大分子构象及位置变化的方法，来有利地克服现有技术的上述缺点和不足。本专利技术是基于荧光共振能量转移原理FRET，其中，供体与受体间的能量转移效率E定义为:J(λ)＝∫0∞FD(λ)EA(λ)λ4dλ(3)τD＝1/kD(4)其中R为两荧光探针间的距离，R0为特征淬灭距离，转移效率E为50％时所对应的距离。由于供受体间距离R与转移效率E之间是六次方反比关系，因此E对空间距离十分敏感，这也是荧光共振转移可以用来测量纳米量级距离的原因。R0是由偶极近似计算得到，其中，QD为供体量子产率，n为介质的折射率，κ2是两个荧光分子之间的偶极取向因子，εA是受体最大的消光系数，J(λ)为归一化的供体发射光谱FD与受体吸收光谱EA的光谱重合系数，kD表示供体分子荧光发射速率。基于以上原理，本专利技术提供了一种原位观察细胞膜及其附近生物大分子的方法，包括如下步骤：步骤1、基于待观测的荧光供体选择符合FRET特征的淬灭剂作为荧光受体，其中所述淬灭剂是无法自发扩散进入细胞膜内部的淬灭剂；步骤2、使用所述荧光供体标记待观测的生物大分子，记录其原始荧光寿命τD及原始荧光强度ID；步骤3、模拟计算得到某一浓度的所述淬灭剂作用于所述荧光供体时R与IDA/ID的关系，或者R与τDA/τD的关系，其中R是所述淬灭剂与荧光供体的距离，IDA是测定的受所述淬灭剂作用的荧光供体的荧光强度，τDA是测定的受所述淬灭剂作用的荧光供体的荧光寿命；步骤4、用所述浓度的淬灭剂与标记有荧光标记大分子的细胞膜进行接触并记录所述荧光标记大分子的荧光信息，根据步骤3所述关系确定所述荧光标记大分子在所述细胞膜表面的径向距离；其中，步骤1和步骤2顺序可以互换。作为上述方法的优选，步骤3包括：步骤301，获得所述浓度值下淬灭剂荧光吸收谱FD(λ)和供体荧光发射谱EA(λ)；步骤302，根据FD(λ)和EA(λ)计算单个所述供体分子与受体分子之间的荧光共振能量转移距离常数R0，其中所述计算采用如下公式：J(λ)＝∫0∞FD(λ)EA(λ)λ4dλ；其中，QD为供体量子产率，n为介质的折射率，κ2是两个荧光分子之间的偶极取向因子，εA是受体最大的消光系数，J(λ)为归一化的供体发射光谱FD与受体吸收光谱EA的光谱重合系数；步骤303，如果R0处于0.1-20nm范围内，使用计算机模拟一定体积的所述浓度的淬灭剂分子，得到R与IDA/ID的关系，或者R与τDA/τD的关系，其中所述计算机模拟是以荧光共振能量转移原理的以下公式为基础而构建：如果R0在0.1-20nm范围之外，回到步骤1。作为本专利技术的一个优选方案，其中所述淬灭剂是不具有细胞毒性的淬灭剂。作为本专利技术的另一个优选方案，其中步骤1中所述荧光供体标记的待观测的生物大分子只具有单一荧光寿命峰值。作为本专利技术的另一个优选方案，其中观测在细胞膜外侧小叶上的大分子运动时，R0需要处于1-5nm范围内；观测在细胞膜内侧小叶上的大分子运动时，R0需要处于4-8nm范围内；观测在细胞膜内的大分子运动时，R0需要处于7-20nm范围内。作为本专利技术的另一个优选方案，其中步骤4所述的记录大分子荧光信息是使用荧光共聚焦显微镜记录所述荧光标记大分子的荧光信息，其中所述显微镜的激光器为皮秒脉冲激光器，接收器为单光子探测器，计数器为时间相关单分子计数卡。作为本专利技术的再一个优选方案，其中所述步骤4是使用全内反射显微镜记录单个大分子的荧光信息，步骤4包括：步骤401，使用所述荧光标记大分子对所述细胞膜进行标记；步骤402，使所述淬灭剂与所述细胞膜进行接触；步骤403，使用全内反射显微镜对观测目标之外的荧光标记大分子进行光漂白，并记录待观测单个荧光标记大分子的荧光强度信息；步骤404，根据步骤3所述关系，由所述单个荧光标记大分子的荧光强度信息计算其在细胞膜表面的径向运动信息。在上述方法中的进一步优选，其中所述全内反射显微镜使用电荷耦合器件图像传感器记录所述单个荧光标记大分子的荧光强度信息。作为上述方法的又一个优选方法，其中所述荧光标记大分子的荧光标记量小于等于10-12个/m2，并且所述显微镜的全反射光场照明深度在进行所述光漂白时小于等于50nm，在记录所述荧光强度信息时大于100nm。本专利技术的有益效果:1、本专利技术的基于FRET原理的原位观察活细胞膜及其附近生物大分子构象变化与运动的方法能够大幅提高观察沿细胞膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原位观察细胞膜及其附近生物大分子的方法，其中包括如下步骤：/n步骤1、基于待观测的荧光供体选择符合FRET特征的淬灭剂作为荧光受体，其中选择所述淬灭剂使其无法自发扩散进入细胞膜内部；/n步骤2、使用所述荧光供体标记待观测的生物大分子，记录其原始荧光寿命τ

【技术特征摘要】
1.一种原位观察细胞膜及其附近生物大分子的方法，其中包括如下步骤：
步骤1、基于待观测的荧光供体选择符合FRET特征的淬灭剂作为荧光受体，其中选择所述淬灭剂使其无法自发扩散进入细胞膜内部；
步骤2、使用所述荧光供体标记待观测的生物大分子，记录其原始荧光寿命τD或原始荧光强度ID；
步骤3、模拟计算得到某一浓度的所述淬灭剂作用于所述荧光供体时R与IDA/ID的关系，或者R与τDA/τD的关系，其中R是所述淬灭剂与荧光供体的距离，IDA是测定的受所述淬灭剂作用的荧光供体的荧光强度，τDA是测定的受所述淬灭剂作用的荧光供体的荧光寿命；
步骤4、用所述浓度的淬灭剂与标记有荧光标记生物大分子的细胞膜进行接触并记录所述荧光标记生物大分子的荧光信息，根据步骤3所确定的关系确定所述荧光标记生物大分子在所述细胞膜表面的径向距离；
其中，步骤1和步骤2顺序为任意的。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述淬灭剂对被观察细胞不具有细胞毒性。


3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1中，选择所述荧光供体，使得标记的待观测的生物大分子只具有单一荧光寿命峰值。


4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3包括：
步骤301，获得所述浓度值下淬灭剂荧光吸收谱FD(λ)和供体荧光发射谱EA(λ)；
步骤302，根据FD(λ)和EA(λ)计算单个所述供体分子与受体分子之间的荧光共振能量转移距离常数R0，其中所述计算采用如下公式：



J(λ)＝∫0∞FD(λ)EA(λ)λ4dλ；
其中，QD为供体量子产率，n为介质的折射率，κ2是两个荧光分子之间的偶极取向因子，εA是受体最大的消光系数，J(λ)为归一化的供体发射光谱FD与受体吸收光谱EA的光谱重合系数；
步骤303，如果R0处于0.1-20nm范围内，使用计算机模拟一定体积的所述浓度的淬灭剂分子，得到R与IDA/ID的关系，或者R与τDA/τD的关系，其中所述计算机模拟...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯文清，陆颖，马东飞，贺小龙，李明，
申请(专利权)人：中国科学院物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11