一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，具体公开一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用。所述检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针中，上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的序列如SEQIDNO:2所示，探针的序列如SEQIDNO:3所示。利用本发明专利技术的引物和探针的组合，可实现对鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RAA检测，该检测方法兼具特异性高、灵敏度好以及准确高效的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用
本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用。
技术介绍
传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirous，IBV)引起的一种鸡的呼吸系统疾病，是一种常见的接触性、急性呼吸道疫病。患有该疫病的鸡会出现咳嗽、打喷嚏、产蛋量和产蛋品质下降的症状，给养殖业带来较大的经济损失。IBV的血清型较多，并且不同的血清型之间的交叉保护性基本没有或者十分微弱，容易造成免疫失败，给IB的防治带来极大的困难。同时，IB与多种禽类呼吸道疫病如传染性喉气管炎(Infectiouslaryngotracheitis)、禽流感(Avianinfluenza)、鸡新城疫(NewcastleDisease)等呼吸道症状相似，导致临床诊断比较困难，延误最佳治疗时机，导致治疗失败。传统PCR方法中需要琼脂糖凝胶电泳观察结果，存在灵敏度不高、耗时长、需使用致癌的EB染料等弊端。
技术实现思路
针对现有传染性支气管炎诊断过程存在的上述问题，本专利技术提供一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用，利用该检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针可在恒温条件下快速检测出传染性支气管炎病毒，且具有特异性好、灵敏度和准确度高的优势，为快速、简便且准确诊断出IB提供了基础。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，所述引物的序列为：上游引物：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′(SEQIDNO:1)；下游引物：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′(SEQIDNO:2)；所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGCTGC(去除碱基修饰THF)TAAGGGTGCTGATGTA-3′(SEQIDNO:3)。相对于现有技术，本专利技术提供的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，可以特异性的结合到鸡传染性支气管炎病毒的cDNA上，准确检测出鸡传染性支气管炎病毒，且与鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和禽流感病毒等无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到10拷贝/μL(3.18×10-9ng/μL)，能实现对鸡传染性支气管炎疾病的早期诊断和实时监测，且检测准确度高、用时短，在37℃下进行重组酶介导等温核酸扩增，仅需要20min即可进行对检测结果的判断，对反应条件和设备要求低。因此，上述引物和探针的组合，对鸡传染性支气管炎病毒进行检测，兼具特异性高、灵敏度好以及准确高效的优点，为鸡传染性支气管炎病毒的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障。优选的，所述探针上标记有荧光基团和淬灭基团。优选的，标记所述荧光基团和所述淬灭基团的所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGC/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/AAGGGTGCTGATGTA-3′。优选的，对所述探针的3′端进行C3封闭。本专利技术还提供一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，该试剂盒包含所述的引物和探针。优选的，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。本专利技术还提供了利用所述试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，具体检测方法为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。利用上述试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，具有耗时短、反应条件简单、反应结果直观，可实现对鸡传染性支气管炎病毒快速检测。优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37-41℃，20-25min。优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37℃，20min。附图说明图1是本专利技术实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法在不同温度条件下检测到荧光值随扩增时间变化的曲线图；图2是本专利技术实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法对IBV、NDV、AIV和ILTV进行检测得到的扩增曲线图；其中，1、IBV，2、NDV，3、AIV，4、ILTV，5、蒸馏水；图3是本专利技术实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法在不同浓度的模板下获得的扩增曲线图；其中，1、蒸馏水，2、100拷贝/μL，3、101拷贝/μL，4、102拷贝/μL，5、103拷贝/μL，6、104拷贝/μL。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例11、材料与方法1.1、DNA/RNA样本的提取及保存鸡传染性支气管炎病毒IBV(AV1511)和鸡传染性喉气管炎病毒ILTV(AV195)由中国兽医药品监察所提供；禽流感病毒AIV和鸡新城疫病毒NDV均为本实验室临床检测后保存。病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。2、引物和探针的设计根据IBV基因组中保守稳定的NA基因序列(SequenceID:HM159258.1)，设计引物和探针，设计得到的引物序列如表1所示，并由上海生工生物工程有限公司合成。表1引物和探针1.3、病毒DNA/RNA的提取按照天根病毒DNA/RNA提取试剂盒使用说明书分别提取IBV、AIV、NDV和ILTV的DNA/RNA；对62份临床疑似传染性支气管炎病鸡的咽拭子样本提取病毒DNA/RNA，以供后续检测。1.4、用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法的建立上述试剂盒包括IBV-RAA-F、BV-RAA-R、IBV-T、荧光基础缓冲液(VI缓冲液)、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。提取待测病毒的基因组为模板，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增(RFQ-RT-RAA)，并在扩增过程中进行实时荧光检测。进行重组酶介导等温核酸扩增的体系包括以下试剂及用量：其中，280mM的醋酸镁在进行扩增前再加入反应体系中。将上述扩增体系放入恒温核酸扩增仪中混匀，混匀后，立即取出后放入RAA恒温荧光检测仪(江苏奇天生物科技有限公司)中进行扩增反应。反应过程中收集FAM信号。1.5、检测鸡传染性支气管炎病毒的方法的优化按照上述重组酶介导等温核酸扩增体系(RFQ-RT-RAA反应体系)，对反应温度和时间进行优化，将RAA恒温荧光检测仪的温度分别设本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：/n上游引物：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′；/n下游引物：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′；/n所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGCTGATGTA-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：
上游引物：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′；
下游引物：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′；
所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGCTGATGTA-3′。


2.如权利要求1所述的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：所述探针上标记有荧光基团和淬灭基团。


3.如权利要求2所述的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：标记所述荧光基团和所述淬灭基团的所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGC/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/AAGGGTGCTGATGTA-3′。


4.如权利要求1所述的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：对所述探针的3′端进行C3封闭。


5.一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张铁，王文静，王春光，李馨月，石建存，李希明，曹立辉，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13