一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒，本发明专利技术以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分口蹄疫与小反刍兽疫，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样双指标检测，又使用户操作简便。

【技术实现步骤摘要】
一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒。
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)，俗名“口疮”、“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。症状主要是二至三天后快速下降的高烧；口中的水疱导致粘性或泡沫状唾液的过度分泌并流淌出口外；足部的水泡有可能破裂并导致残废。成年动物感染后可能会伴有数月无法恢复的体重减轻，以及成年雄性动物的睾丸肿胀，对于母牛，牛奶产量会明显减少。虽然大部分动物得病后可自行恢复，但该疾病严重时亦可能导致心肌炎或死亡。小反刍兽疫(pestedespetitsruminants，PPR)俗称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病。感染动物临诊症状与牛瘟病牛相似。急性型体温可上升至41℃，并持续3～5天。感染动物烦躁不安，背毛无光，口鼻干燥，食欲减退。流黏液脓性鼻漏，呼出恶臭气体。在发热的前4天，口腔黏膜充血，颊黏膜进行性广泛性损害、导致多涎，随后出现坏死性病灶，开始口腔黏膜出现小的粗糙的红色浅表坏死病灶，以后变成粉红色，感染部位包括下唇、下齿龈等处。严重病例可见坏死病灶波及齿垫、腭、颊部及其乳头、舌头等处。后期出现带血水样腹泻，严重脱水，消瘦，随之体温下降。出现咳嗽、呼吸异常。发病率高达100％，在严重暴发时，死亡率为100％。目前的对上述两种疾病的诊断方法是RT-PCR法。采用现有的PCR技术，由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物及试剂盒。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物，具体为：FMDV-F3：AGGTTTCCACAACTGACACA；FMDV-B3：GTTAGGACGTGGCTTTCGG；FMDV-FIP：CGAGCGTGGAGTCAAACACAGT-GTGCAATTTGAAACTCCGCC；FMDV-BIP：AGCGAGTGCTAGTAGCAGCAC-CGGGTCCTTGTCACCAAG。PPRV-F3：GGTCTCCTTCCTCCAGCA；PPRV-B3：GCCTCACGAGGGTTTTGAC；PPRV-FIP：TCCCTTCCTTCGGACCCATTTG-GGAGAGTCGCCTACACCA；PPRV-BIP：AACACGCTCAGGAAAGCCCAG-TCTCGCGAGAGTTCATCCTC。本专利技术还提供一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的组成为：所述口蹄疫引物的浓度和体积为：90μM的FMDV-F3引物0.5μL、90μM的FMDV-B3引物0.5μL、180μM的FMDV-FIP引物2μL、180μM的FMDV-BIP引物2μL。所述小反刍兽疫引物的浓度和体积为：90μM的PPRV-F3引物0.5μL、90μM的PPRV-B3引物0.5μL、180μM的PPRV-FIP引物2μL、180μM的PPRV-BIP引物2μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增FMDV序列的引物和第2检测孔包埋扩增PPRV序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，如图1，冻干。所述口蹄疫病毒的核酸序列为M29409.1，小反刍兽疫病毒的核酸序列为HQ197753.1。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分口蹄疫与小反刍兽疫，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样双指标检测，又使用户操作简便。附图说明图1是8样本芯片测试孔位图。图2是FMDV和PPRV引物敏感性扩增结果图；图中A为FMDV敏感性扩增结果，B为PPRV敏感性扩增结果。图3是FMDV和PPRV引物重复性扩增图；图中A为FMDV重复性扩增结果，B为PPRV重复性扩增结果。图4是FMDV和PPRV引物特异性扩增图；图中A为FMDV引物特异性扩增结果；B为PPRV引物特异性扩增结果。具体实施方式实施例1先通过NCBIGenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从鼻拭子及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，上述仪器和芯片均为市售产品，宁波爱基因科技有限公司也有相应公开产品，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有口蹄疫和小反刍兽疫病毒。具体的操作步骤如下：1、微流控芯片检测体系中18μL反应液的组成如下：所述引物的浓度和体积为：90μM的FMDV-F3引物0.5μL、90μM的FMDV-B3引物0.5μL、180μM的FMDV-FIP引物2μL、180μM的FMDV-BIP引物2μL。所述小反刍兽疫引物的浓度和体积为：90μM的PPRV-F3引物0.5μL、90μM的PPRV-B3引物0.5μL、180μM的PPRV-FIP引物2μL、180μM的PPRV-BIP引物2μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增FMDV序列的引物和第2检测孔包埋扩增PPRV序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物(如图1)，冻干。所述口蹄疫病毒的核酸序列为M29409.1，小反刍兽疫病毒的核酸序列为HQ197753.1。取16μL的FMDV的核酸，该核酸序列为M29409.1；取16μL的PPRV的核酸，该核酸序列为HQ197753.1，两核酸充分混匀，然后将反应液18μL与FMDV和PPRV模板核酸32μL混合，加入到芯片的加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；2、微流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物，其特征在于，具体为：/nFMDV-F3：AGGTTTCCACAACTGACACA；/nFMDV-B3：GTTAGGACGTGGCTTTCGG；/nFMDV-FIP：/nCGAGCGTGGAGTCAAACACAGT-GTGCAATTTGAAACTCCGCC；/nFMDV-BIP：/nAGCGAGTGCTAGTAGCAGCAC-CGGGTCCTTGTCACCAAG；/nPPRV-F3：GGTCTCCTTCCTCCAGCA；/nPPRV-B3：GCCTCACGAGGGTTTTGAC；/nPPRV-FIP：TCCCTTCCTTCGGACCCATTTG-GGAGAGTCGCCTACACCA；/nPPRV-BIP：/nAACACGCTCAGGAAAGCCCAG-TCTCGCGAGAGTTCATCCTC。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物，其特征在于，具体为：
FMDV-F3：AGGTTTCCACAACTGACACA；
FMDV-B3：GTTAGGACGTGGCTTTCGG；
FMDV-FIP：
CGAGCGTGGAGTCAAACACAGT-GTGCAATTTGAAACTCCGCC；
FMDV-BIP：
AGCGAGTGCTAGTAGCAGCAC-CGGGTCCTTGTCACCAAG；
PPRV-F3：GGTCTCCTTCCTCCAGCA；
PPRV-B3：GCCTCACGAGGGTTTTGAC；
PPRV-FIP：TCCCTTCCTTCGGACCCATTTG-GGAGAGTCGCCTACACCA；
PPRV-BIP：
AACACGCTCAGGAAAGCCCAG-TCTCGCGAGAGTTCATCCTC。


2.一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物以及反应液，所述反应液的组成为：
20mMTris-HCl0.2μL
...

【专利技术属性】
技术研发人员：禹思宇，胡忆文，胡仕凤，谭建锡，朱忠武，孟芳，江杰，安家雯，卢先东，刘艳红，
申请(专利权)人：长沙海关技术中心，宁波爱基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43