检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒制造技术

本发明专利技术公布了检测新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)及其B.1.1.7突变株的寡核苷酸和试剂盒。本发明专利技术采用荧光RT‑PCR方法，针对突变位点N501Y和缺失位点HV69‑70del设计特异性引物，结合荧光探针信号，快速识别B.1.1.7突变株；同时本发明专利技术也可以鉴定SARS‑CoV‑2RdRp基因，用于检测SARS‑CoV‑2。

【技术实现步骤摘要】
检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒
本专利技术属于生命科学和生物
，特别涉及一种用于检测SARS-CoV-2及其B.1.1.7突变株的引物、探针、方法和试剂盒，采用荧光RT-PCR技术，用于检测临床样本中的SARS-CoV-2及其B.1.1.7突变株。
技术介绍
冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的冠状病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒主要引起呼吸道和胃肠道感染，并且在遗传学上被分为四个主要的病毒属：甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)、乙型冠状病毒(Betacoronavirus)、丙型冠状病毒(Gammacoronavirus)和丁型冠状病毒(Deltacoronavirus)。前两个属主要感染哺乳动物，而后两个属主要感染鸟类。人们先前已鉴定六种人类冠状病毒，包括HCoV-NL63和HCoV-229E，它们属于甲型冠状病毒；HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)，属于乙型冠状病毒。直到2003年SARS大流行和2012年MERS疫情发生后，冠状病毒才引起全球关注。SARS-CoV和MERS-CoV被认为是高致病性的，而且SARS-CoV和MERS-CoV可能由蝙蝠传播给果子狸或单峰驼，最后传播给人类。一种称为SARS-CoV-2的新型冠状病毒导致包括中国在内的全世界绝大多数国家和地区发生病毒性肺炎。SARS-CoV-2可导致2019年冠状病毒病(COVID-19)。通过对现有病例的观察和研究，SARS-CoV-2感染人体后的潜伏期中位数为3天，最长可达24天(Wei-jieGuanetal.ClinicalCharacteristicsofCoronavirusDisease2019inChina.NEJM,28February2020,doi:10.1056/NEJMoa2002032)；此外，有人估算SARS-CoV-2的基本再生数(R0)为3.6～4.0(95％置信区间)(JonathanMReadetal.Novelcoronavirus2019-nCoV:earlyestimationofepidemiologicalparametersandepidemicpredictions.medRxiv,28January2020,doi:10.1101/2020.01.23.20018549)。2020年12月，英国科学家发现了一种被称为B.1.1.7的SARS-CoV-2变种，引起世界一片哗然。《科学》杂志刊文称，变种病毒传播能力要比原始毒株高70％左右，而伦敦最近SARS-CoV-2感染病例超过60％都来自这种变种病毒。《科学》杂志称，病毒复制时会产生突变，研究人员观察B.1.1.7变种病毒的基因组时，被它已经出现17个位点的大量突变震惊。据英国广播公司(BBC)报道，B.1.1.7变种病毒最早在9月被发现，到了11月，伦敦大约有四分之一的SARS-CoV-2感染病例与该变种病毒有关，12月中旬，这一数字已接近三分之二。鉴于SARS-CoV-2及B.1.1.7突变株病例的出现和迅速增加给全球公共卫生、研究界和医学界带来了复杂的挑战。疫情提醒人们正在出现和重新出现传染性病原体的挑战。对SARS-CoV-2及其突变株进行持续监测、及时诊断和开展强有力的研究以了解这种新型病原体及其变种病毒的基本生物学特性有助人们制定有效的对策。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于检测SARS-CoV-2及其B.1.1.7突变株的方法、寡核苷酸和试剂盒，选择了B.1.1.7突变株位点N501Y和缺失突变位点HV69-70del，设计引物探针，采用荧光RT-PCR方法快速鉴别B.1.1.7突变株；在SARS-CoV-2RdRp基因保守性区域设计引物探针，同时引入针对RNaseP(HumanRNasePprotein)基因的扩增引物和探针，可以有效地避免检测临床样本时遇到的假阴性。在本专利技术中，位于每条探针5’端的x1、x2、x3和x4为荧光报告基团，位于每条探针5’端的y1、y2、y3和y4为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团。本专利技术中的同一条探针的荧光报告基因和淬灭基团以诸如“FAM-TARMA/BHQ1”或“VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1”之类的形式给出，“-”左边的表示荧光报告基团，“-”右边的表示淬灭基团。FAM-TARMA/BHQ1表示一条探针的荧光报告基因为FAM，淬灭基团可选自TARMA或BHQ1。VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1表示，一条探针的荧光报告基因可选自VIC、HEX或JOE，淬灭基团可选自TAMRA或BHQ1。本专利技术提供用于检测SARS-CoV-2的寡核苷酸，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测突变位点N501Y的第一引物对和第一探针；(2)用于检测缺失位点HV69-70del的第二引物对和第二探针；(3)用于检测SARS-CoV-2RdRp基因保守性区域的第三引物对和第三探针。本专利技术还提供用于检测B.1.1.7突变株的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括：(1)用于检测突变位点N501Y的第一引物对和第一探针；(2)用于检测缺失位点HV69-70del的第二引物对和第二探针；(3)用于检测SARS-CoV-2RdRp基因保守性区域的第三引物对和第三探针。进一步地，所述寡核苷酸包括(4)用于检测内参基因的第四引物对和第四探针。进一步地，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQIDNO:1～3。进一步地，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQIDNO:4～6。进一步地，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQIDNO:7～9。进一步地，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQIDNO:10～12。进一步地，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/TexasRed-BHQ2和Cy5/LCRed640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。本专利技术还提供一种检测B.1.1.7突变株的方法，所述方法包括：(1)提取样本中的核酸；(2)采用荧光RT-PCR方法确定样本中是否存在SARS-CoV-2，其中，所述一组引物和探针的碱基序列为SEQIDNO:1～12。本专利技术还提供一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括荧光RT-PCR反应液，所述荧光RT-PCR反应液包括寡核苷酸，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测突变位点N501Y的第一引物对和第一探针；(2)用于检测缺失位点HV69-70del的第二引物对和第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测SARS-CoV-2的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测突变位点N501Y的第一引物对和第一探针；(2)用于检测缺失位点HV69-70del的第二引物对和第二探针；(3)用于检测SARS-CoV-2RdRp基因保守性区域的第三引物对和第三探针。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测SARS-CoV-2的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸至少包括(1)～(3)中的一种：(1)用于检测突变位点N501Y的第一引物对和第一探针；(2)用于检测缺失位点HV69-70del的第二引物对和第二探针；(3)用于检测SARS-CoV-2RdRp基因保守性区域的第三引物对和第三探针。


2.用于检测B.1.1.7突变株的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括：(1)用于检测突变位点N501Y的第一引物对和第一探针；(2)用于检测缺失位点HV69-70del的第二引物对和第二探针；(3)用于检测SARS-CoV-2RdRp基因保守性区域的第三引物对和第三探针。


3.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括(4)用于检测内参基因RNaseP基因的第四引物对和第四探针。


4.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQIDNO:1～3。


5.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQIDNO:4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张太松，刘学锋，刘娜娜，朱丽敏，
申请(专利权)人：利多香港有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81