本发明专利技术公开了一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用，所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。本发明专利技术的肿瘤组织标本检测基因DNA突变位点稳定性好，临床可操性强，检测过程简便。本发明专利技术可用于区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者，使其在新辅助放化疗中显著获益。
【技术实现步骤摘要】
检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物医学诊断
，具体涉及一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤中，结直肠癌发病率在全球排名第3、我国排名第5；其发病率呈现快速上升且年轻化的趋势，是影响我国社会发展的常见恶性肿瘤，严重危害人类健康。新辅助放化疗是直肠癌整体治疗策略的主要组成部分，而新辅助放化疗敏感性在个体间存在显著差异。新辅助放化疗后肿瘤退缩的程度与患者的长期生存率和生存质量显著相关，新辅助放化疗后手术时约30％患者可达到完全病理缓解，如果能提前预测肿瘤的退缩，在新辅助放化疗后采用前瞻性严密的等待和观察策略，可以使这部分患者避免手术保留肛门；另有部分患者即使接受了强烈的新辅助放化疗，肿瘤退缩仍不尽人意，如果能提前预测肿瘤退缩有限，则可以从治疗初始调整治疗策略和增加治疗强度，以提高这部分患者的生存率，延长生存时间。直肠是非常特殊的器官，根据最大程度的根治肿瘤和最大程度的保证脏器功能两大原则，能够在保证肿瘤疗效的同时最大程度保存患者生存质量，尽可能提高不良预后患者的疗效，是直肠癌治疗领域急需开展的工作。DNA是遗传物质，是所有生物性状最决定性的因素。人类95％的疾病与基因相关，每个人的基因信息都不一样，基因信息不仅是生命科学研究的重要内容，更是人类攻克疑难病症的重要依据。高通量二代基因测序技术，又称“新一代测序技术”，基于平行测定几十万到几百万条DNA分子序列以及后续的数据处理和比对，高通量二代基因测序技术允许同时检测多种类型的基因遗传变异，包括单核苷酸变异(SNV)，小的插入/缺失(indel)以及拷贝数变异(CNVs)或复杂的基因组重排。当前，国内外对直肠癌术前放化疗后病理完全缓解的预测尚缺乏DNA层面基因测序的研究；既往研究中，临床因素(初始临床分期、癌胚抗原水平等)对新辅助放化疗后疗效预测效果不佳。文献中探讨过至少40种不同的可能与直肠癌新辅助放化疗敏感性相关的分子指标，例如TP53、KRAS、TYMS、MTHFR等基因，结果一致性非常不理想，相互矛盾的结果常有存在。除TP53基因突变以外，其余基因突变与直肠癌新辅助放化疗敏感性的关系没有得到多个研究的证实。当前临床和分子指标用于预测新辅助放化疗后疗效的效能十分有限，局限于理论和经验挑选研究对象，注定难以高效挖掘出大量影响研究结局的分标记。因此，结合临床病理特征联合基因检测建立直肠癌新辅助放化疗后疗效精准预测模型是决定直肠癌精准个体化医疗能否成功的关键因素。
技术实现思路
有鉴于此，为了克服现有技术中的不足之处，本专利技术的所解决的技术问题在于提供一种一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒，能够稳定、有效地基于基因DNA突变位点预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性，筛选对放化疗敏感的患者，使其在新辅助放化疗中显著获益。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案的如下：一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。所述特异性引物如下表所示：进一步地，所述的基因DNA突变位点如下：chr6_33052958_C_T、chr9_125316157_C_T、chr9_123850770_G_A、chr3_122259606_T_C、chr6_160211646_GTT_、chr1_160920966_C_T、chr8_23294761_T_C、chr7_122635024_C_T、chr6_56420538_C_T、chr1_232574921_T_C、chr8_21862551_A_G、chr11_66254085_G_T、chr5_55406952_T_C、chr19_45001346_G_A、chr16_58318604_T_C、chr1_150679033_G_A、chr21_47974582_A_G、chr11_44636833_G_A。进一步地，所述试剂盒还包括用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂。更进一步地，所述用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂为二代测序试剂。另一方面，本专利技术还提供了该试剂盒在作为预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的检测试剂中的应用。具体而言，所述的局部晚期直肠癌为NCCN指南推荐应用新辅助芳华路的II期、III期局部晚期直肠癌。所述的基因DNA突变位点，在对放化疗敏感的患者肿瘤组织中，其基因突变频率高于对放化疗不敏感的患者。为了实现该试剂盒在作为预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的检测试剂中的应用，须按照如下步骤建立18个基因DNA突变位点组成的预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的预测模型：(1)基于二代测序方法，通过全外显子测序筛选局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者差异的候选基因DNA突变位点；(2)靶向测序验证候选基因DNA突变位点；(3)在由局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者组成的训练组中确立可区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者的基因DNA突变位点组合；(4)在两个独立验证组验证步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果；(5)采用逻辑回归模型，分析步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果。更进一步地，所述逻辑回归模型中所用的逻辑回归公式为：logit[p＝Logit(P＝PCR)＝-2.66E+01+5.31E+01*chr6_33052958_C_T-5.63E-12*chr9_125316157_C_T+9.19E-12*chr9_123850770_G_A+2.73E-12*chr3_122259606_T_C-3.81E-12*chr6_160211646_GTT_.+8.70E-12*chr1_160920966_C_T-8.87E-13*chr8_23294761_T_C-3.64E-12*chr7_122635024_C_T+1.72E-13*chr6_56420538_C_T+4.01E-12*chr1_232574921_T_C-7.88E-12*chr8_21862551_A_G+1.36E-12*chr11_66254085_G_T+1.05E-11*chr17_25970633_G_A-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的基因DNA突变位点如下：chr6_33052958_C_T、chr9_125316157_C_T、chr9_123850770_G_A、chr3_122259606_T_C、chr6_160211646_GTT_、chr1_160920966_C_T、chr8_23294761_T_C、chr7_122635024_C_T、chr6_56420538_C_T、chr1_232574921_T_C、chr8_21862551_A_G、chr11_66254085_G_T、chr5_55406952_T_C、chr19_45001346_G_A、chr16_58318604_T_C、chr1_150679033_G_A、chr21_47974582_A_G、chr11_44636833_G_A。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂为二代测序试剂。
5.如权利要求1所述的试剂盒在作为预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5的所述的应用，其特征在于：所述的局部晚期直肠癌为NCCN指南推荐应用新辅助芳华路的II期、III期局部晚期直肠癌。
7.根据权利要求5的所述的应用，其特征在于：在该应用的实际预测过程中，须按照如下步骤建立18个基因DNA突变位点组成的预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的预测模型：
(1)基于二代测序方法，通过...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖巍魏，高远红，李敏，王穗海，李明，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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