一种表达冠状病毒受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体制造技术

本发明专利技术公开一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。实验证明rPIV5‑tr‑RBD对2019‑nCoV冠状病毒具有优良的免疫保护效果。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种表达冠状病毒受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种表达冠状病毒受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体。
技术介绍
新冠肺炎的临床症状包括发热、干咳、乏力等，患者可出现鼻塞、流涕、咽痛、结膜炎等多种症状，重症患者可出现呼吸困难、低氧血症，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克等甚至导致死亡。疫苗接种是预防新冠病毒的最有效手段之一，目前各国已有多个研究机构进行新冠疫苗的制备，包括灭活疫苗，重组蛋白疫苗，重组腺病毒疫苗，mRNA疫苗以及病毒载体疫苗等。灭活疫苗可以有效地激发高水平的体液免疫，相对安全，但不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应，不能够产生局部免疫反应；重组蛋白疫苗技术成熟，不良反应小，但生产速度较慢；重组腺病毒疫苗虽然免疫效果好，但可能会存在一定的不良反应，且人体内可能含有针对腺病毒载体的抗体，会影响疫苗效果；mRNA疫苗相对效果好，但存储运输条件相对较为苛刻，成本较高。病毒载体疫苗具有多种优势，由于是活病毒载体，可在免疫动物体内进行复制，诱导较强的免疫反应；可通过自然感染，如滴鼻、喷雾等方式进行免疫；可产生体液免疫与细胞免疫，除了激发全身免疫反应外，还可激发局部免疫反应，如在呼吸道中产生sIgA抗体，发挥较强的免疫保护效果。目前，在新冠疫苗的研发过程中，已有多种病毒载体疫苗在研发过程中，并在动物模型中具有良好的免疫保护效果，如黄热病毒、痘病毒、新城疫病毒、水疱口炎病毒等。副流感病毒5型(PIV5)作为预防犬窝咳的疫苗在犬中应用已有数十年的历史，而且未被证实可引起任何其他动物包括人致病。
技术实现思路
本专利技术提供一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体(TandemrepeatReceptor-bindingdomain,tr-RBD)的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。可选的，所述冠状病毒为2019-nCoV。可选的，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因核苷酸序列，所得；所述序列甲为如下1)或2)或3)：A)SEQIDNO：1所示DNA分子；B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的DNA序列；C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的DNA序列。可选的，所述表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列如SEQID：NO：1所示；所述表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体基因序列编码的蛋白的氨基酸序列为SEQID：NO：2所示。可选的，所述副流感病毒5型基因组为将SEQIDNO：6所示的核苷酸序列的第6303-6437位的核苷酸序列替换为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。一种组合物，包括重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L；所述表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L是将副流感病毒5型的NP、P和L蛋白的编码基因分别插入哺乳动物表达载体中，得到辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L，。可选的，NP蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；P蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；L蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。可选的，哺乳动物表达载体为pcDNA3.1(+)。所述冠状病毒为2019-nCoV。一种在细胞中表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的方法，该方法包括使该细胞与上述的重组副流感病毒5型载体相接触。一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体的制备方法，包括如下步骤：1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cDNA插入克隆载体中，得到重组质粒pPIV5；2)用序列甲替换步骤1)中重组质粒pPIV5中副流感病毒5型的小疏水蛋白基因核苷酸序列；所述序列乙为如下1)或2)或3)：A)SEQIDNO：1所示DNA分子；B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的DNA序列；C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的DNA序列。可选的，步骤1)中所述克隆载体为带有T7RNA聚合酶启动子序列、带有丁肝核酶序列、T7RNA聚合酶转录终止序列的克隆载体。一种新型冠状病毒(2019-nCoV)疫苗的制备方法，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L共转染宿主细胞。可选的，所述宿主细胞为BSR-T7细胞，MDBK细胞,Vero细胞或BHK细胞。上述方法制备得到的疫苗。重组副流感病毒5型载体或上述方法制备的重组副流感病毒5型载体在如下任一一种中的应用：(1)制备提高动物体内针对冠状病毒2019-nCoVSpike蛋白抗体水平的产品中的应用；(2)制备预防或辅助预防冠状病毒2019-nCoV引起的疾病产品中的应用。本专利技术技术方案，具有如下优点：本专利技术提供一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。实验第1、第15天，两次向BALB/c小鼠滴鼻接种疫苗(重组副流感病毒5型rPIV5-tr-RBD)，免疫重组病毒rPIV5-tr-RBD组小鼠体内产生针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体，而rPIV5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体。表明rPIV5-tr-RBD重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对Spike蛋白的特异性抗体。实验第1、第15天，两次向BALB/c小鼠滴鼻接种rPIV5-tr-RBD，首免后6周，鼻腔接种2019-nCoV冠状病毒；小鼠攻毒后第3天剖杀，肺脏病原核酸检测结果表明2019-nCoV冠状病毒不能在小鼠肺脏中有效复制。rPIV5-tr-RBD对2019-nCoV冠状病毒具有优良的免疫保护效果。本专利技术具有重要的应用价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述副流感病毒5型基因组包含冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的基因序列。


2.根据权利要求1所述的表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因核苷酸序列，所得；
所述序列甲为如下1)或2)或3)：
A)SEQIDNO：1所示DNA分子；
B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的DNA序列；
C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的DNA序列。


3.一种组合物，其特征在于，包括重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L；所述表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L是将副流感病毒5型的NP、P和L蛋白的编码基因分别插入哺乳动物表达载体中，得到辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L。


4.一种在细胞中表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的方法，其特征在于，该方法包括使该细胞与如权利要求1或2中所述的表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体相接触。


5.一种表达冠状病毒Spike蛋白的受体结合域串联二聚体的重组副流感病毒5型载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cDNA插入克隆载体中，得到重组质粒pPIV5；
2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，孙洪磊，孙浩然，李涵，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11