一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种USP8突变的ACTH腺瘤小鼠动物模型的构建方法及其应用，方法包括：根据基因序列设计sgRNA，构建基因打靶载体peSpCas9‑sgRNA并筛选出活性较高的sgRNA；设计含T7启动子的引物分别扩增eSpCas9及前述活性较高的sgRNA并回收纯化，体外转录试剂盒将eSpCas9、sgRNA分别转录成mRNA；同时，根据靶位点确定供体序列，体外合成Donor DNA oligos；将上述试剂共注射至小鼠受精卵，移植假孕鼠后，获得F0代小鼠；F0小鼠离乳后1周左右剪鼠尾，试剂盒提取基因组DNA，设计特异性引物PCR扩增靶位点附近DNA片段，PCR产物送样测序，获得阳性小鼠。

【技术实现步骤摘要】
一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及动物模型的构建方法领域，特别涉及一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法及其应用。
技术介绍
泛素化特异性蛋白酶USP8突变能诱发ACTH腺瘤。泛素-蛋白酶体系统是细胞内非常重要的蛋白质降解调节系统。近年来，研究发现全基因组外显子测序显示ACTH腺瘤中存在USP8基因体细胞突变，USP8基因突变可能在大量病人中诱发ACTH腺瘤。研究证实全基因组外显子测序显示10例ACTH腺瘤患者中有4例存在USP8基因体细胞突变，所有突变集中在713和720氨基酸之间(USP814-3-3结合域内或邻近位置)。USP8包含一个假定的14-3-3结合结构域RSXSXP，由人类USP814外显子的一部分所编码，其在不同的物种中非常保守。USP814-3-3结合域第4个丝氨酸(S718)的磷酸化导致其与14-3-3蛋白的结合和催化功能失活。研究表明，14-3-3结合域氨基酸偏好在每个位置非常相似，第四个位置丝氨酸的磷酸化对其结合能力至关重要。此外，此丝氨酸(S718)的改变(删除或错义突变)在USP8突变的病人中是最常见的(37/75)。USP8基因突变可能是ACTH垂体腺瘤发病机制的关键事件，因此，需要建立真实模拟USP8突变ACTH腺瘤的人类细胞或动物模型。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提出一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法，以研究ACTH腺瘤的发生机制。本专利技术的第二个目的是提出上述方法构建的小鼠模型在ACTH腺瘤研究中的应用。本专利技术的第三个目的是得到上述方法获得的小鼠动物模型的USP8突变的细胞。为解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立USP814-3-3BMKO小鼠模型，所述方法包括如下步骤：步骤一、根据基因序列设计sgRNA，构建基因打靶载体peSpCas9-sgRNA，并筛选出活性较高的sgRNA；步骤二、设计含T7启动子的引物分别扩增eSpCas9及前述活性较高的sgRNA并回收纯化，体外转录试剂盒将eSpCas9、sgRNA分别转录成mRNA；同时，根据靶位点确定供体序列，体外合成DonorDNAoligos；步骤三、将上述试剂共注射至小鼠受精卵，移植假孕鼠后，获得F0代小鼠；步骤四、F0小鼠离乳后1周左右剪鼠尾，试剂盒提取基因组DNA，设计特异性引物PCR扩增靶位点附近DNA片段，PCR产物送样测序，获得阳性小鼠。作为优选地，本专利技术中设计的sgRNA序列有SEQIDNO：1-3。sgRNA1：GGCCTGAGTGATATCTGGTGAGG(SEQIDNO：1)；sgRNA2：TAGGAGCGCTTCAGTTTCGATGG(SEQIDNO：2)；sgRNA3：CTCCTCACCAGATATCACTCAGG(SEQIDNO：3)；其中sgRNA2为最优sgRNA序列。作为优选地，构建基因打靶载体peSpCas9-sgRNA的步骤：Ensembl数据库查询HumanUSP8基因组DNA序列，根据DNA序列定位至第14个外显子14-3-3蛋白结合结构域，确定其为基因敲除靶位点，设计sgRNA，根据sgRNA设计合成序列互补的DNAoligos，DNAoligos退火并连接至酶切回收的peSpCas9质粒构建打靶载体peSpCas9-sgRNA。作为优选地，所述含T7启动子的引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA(SEQIDNO：4)。作为优选地，所述特异性引物的序列为：ForwardPrimer:GTCTGTGCTTAGCAAATTCAAGGCC(SEQIDNO：5)；ReversePrimer:GGGCATGGTACTGGGAAAGTGCT(SEQIDNO：6)。本专利技术使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过对小鼠胚胎基因组进行编辑，实现了对USP8特定位点的敲除突变，移植至代孕鼠中繁育出F0代小鼠。剪鼠尾对其进行测序分析是判断是否建模成功的第一步。测序结果提示，本专利技术构建成功了杂合子和纯合子小鼠，其USP8特定部位均发生不同程度的突变。附图说明图1为本专利技术的构建方法的原理图；图2为对照组和突变组的垂体组织HE染色对比照片，其中a、b为对照组垂体组织HE染色照片，c、d为突变组的垂体组织HE染色照片；图3为对照组和突变组的肾上腺组织HE染色对比照片，其中a、b为对照组肾上腺组织HE染色照片，c、d为突变组的肾上腺组织HE染色照片；图4为对照组和突变组的肾脏组织HE染色对比照片，其中a、b为对照组肾脏组织HE染色照片，c、d为突变组的肾脏组织HE染色照片；图5为对照组和突变组的肝脏组织HE染色对比照片，其中a、b为对照组肝脏组织HE染色照片，c、d为突变组的肝脏组织HE染色照片；图6为对照组和突变组的股骨组织HE染色对比照片，其中a、b为对照组股骨组织HE染色照片，c、d为突变组的股骨组织HE染色照片；图7为对照组和突变组的胫骨组织HE染色对比照片，其中a、b为对照组胫骨组织HE染色照片，c、d为突变组的胫骨组织HE染色照片；图8为对照组和模型组的颅脑7.0T磁共振扫描图，其中a、b为颅脑7.0T磁共振扫描图，c、d为突变组的颅脑7.0T磁共振扫描图；白色箭头所示为小鼠垂体；图9为对照组和模型组的血液皮质醇浓度检测图；图10为对照组和模型组24小时尿皮质醇检测图；图11为对照组和模型组的血液ACTH检测图；图12为对照组小鼠心脏B超检查图，其中，a、b为对照组1的小鼠心脏B超检查图；c、d为对照组2的小鼠心脏B超检查图；e、f为对照组3的小鼠心脏B超检查图；图13为模型组的小鼠心脏B超检查图；图14为阳性小鼠垂体HE染色图，其中a、b为对照组垂体组织HE染色照片，c、d为突变组的垂体组织HE染色照片；图15为对照组和突变组的垂体组织网状纤维染色对比图片，其中a为对照组垂体网状纤维染色，b为突变组垂体网状纤维染色。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立USP814-3-3BMKO小鼠模型，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一、根据基因序列设计sgRNA，构建基因打靶载体peSpCas9-sgRNA并筛选出活性较高的sgRNA；设计的sgRNA有sgRNA1-3。sgRNA1：GGCCTGAGTGATATCTGGTGAGG；sgRNA2：TAGGAGCGCTTCAGTTTCGATGG；sgRNA3：CTCCTCACCAGATATCACTCAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立USP8 14-3-3 BM KO小鼠模型，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n步骤一、设计sgRNA1-3，构建基因打靶载体peSpCas9-sgRNA并筛选出活性较高的sgRNA；/n其中，sgRNA1的序列为SEQ ID NO：1所示，sgRNA2的序列为SEQ ID NO：2所示，sgRNA3的序列为SEQ ID NO：3所示；/n活性较高的sgRNA为sgRNA2；/n步骤二、设计含T7启动子的引物分别扩增eSpCas9及前述活性较高的sgRNA并回收纯化，体外转录试剂盒将eSpCas9、sgRNA分别转录成mRNA；同时，根据靶位点确定供体序列，体外合成Donor DNA oligos；含T7启动子的引物序列如SEQ ID NO：4所示；/n步骤三、将上述试剂共注射至小鼠受精卵，移植假孕鼠后，获得F0代小鼠即为阳性小鼠。/n

【技术特征摘要】
1.一种USP8突变的小鼠动物模型的构建方法，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立USP814-3-3BMKO小鼠模型，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一、设计sgRNA1-3，构建基因打靶载体peSpCas9-sgRNA并筛选出活性较高的sgRNA；
其中，sgRNA1的序列为SEQIDNO：1所示，sgRNA2的序列为SEQIDNO：2所示，sgRNA3的序列为SEQIDNO：3所示；
活性较高的sgRNA为sgRNA2；
步骤二、设计含T7启动子的引物分别扩增eSpCas9及前述活性较高的sgRNA并回收纯化，体外转录试剂盒将eSpCas9、sgRNA分别转录成mRNA；同时，根据靶位点确定供体序列，体外合成DonorDNAoligos；含T7启动子的引物序列如SEQIDNO：4所示；
步骤三、将上述试剂共注射至小鼠受精卵，移植假孕鼠后，获得F0代小鼠即为阳性小鼠。


2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海军，朱永红，朱迪敏，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44