一种抗玉米病毒的小RNA制造技术

本发明专利技术提供了一种抗玉米病毒的小RNA，属于基因工程领域与作物分子生物学领域。本发明专利技术的小RNA为miR167来源于玉米，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑10任一所示。本发明专利技术发现在玉米中沉默miR167后接种玉米褪绿斑驳病毒MCMV，发现明显增强病毒侵染引起的花叶症状，且MCMV积累水平明显提高；还发现在玉米原生质体中沉默miR167导致MCMV积累增加，而过表达miR167的玉米原生质体中MCMV积累减少，表明miR167在玉米中发挥抗MCMV作用。本发明专利技术表明miR167可用于培育抗MCMV的玉米品种，还可用于抗病植物种质资源的改良及遗传育种领域，具有良好的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种抗玉米病毒的小RNA
本专利技术涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及一种抗玉米病毒的小RNA即miR167及其应用。
技术介绍
玉米是世界主要粮食作物，由病毒侵染引起的玉米致死性坏死病(Maizelethalnecrosis,MLN)是玉米上的主要病害，对玉米安全生产造成巨大威胁。该病主要由玉米褪绿斑驳病毒(maizechloroticmottlevirus,MCMV)与甘蔗花叶病毒(sugarcanemosaicvirus,SCMV)复合侵染造成。MCMV是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，可由种子、汁液、介体甲虫及蓟马等多种途径传播。主要寄主是玉米，在田间还可以侵染高粱、大麦等单子叶植物。MCMV侵染玉米的典型症状是叶片褪绿并伴随花叶，严重时可引起叶片坏死和植株矮化，被我国列入进境植物检疫性有害生物名录。目前，没有任何关于抗MCMV的基因/蛋白或者微小RNA被报道。筛选、培育和种植抗病品种，是防治玉米褪绿斑驳病毒病和MLN病的重要途径。因此寻找有效的抗病毒的基因，通过传统育种方式和分子标记辅助筛选相结合，对于有效的保障玉米产业安全具有重要的意义。微小RNA(microRNA,简称miRNA)是由18-24个核糖核酸组成的短链小分子。miRNA在植物中广泛分布，其在调控植物的生长、发育以及对环境的适应发挥重要的作用。目前，玉米中有502个miRNA被鉴定，但是由于缺乏好的研究工具，玉米中miRNA的功能研究较少被报道，特别是与抗病抗逆相关的报道。短的串联靶标模拟(STTM)是通过吸附植物内源与之匹配的miRNA，可以有效地阻碍内源miRNA的功能的一种技术。最近，我们以一种能侵染玉米并引起轻微花叶症状的黄瓜花叶病毒北京分离物(ZMBJ-CMV)为载体，开发了能够沉默玉米内源miRNA的工具，用于研究玉米中miRNA的功能。利用该工具，我们能够在玉米苗期瞬时阻碍玉米内源的miRNA，鉴定特定miRNA的功能。近年来越来越多的证据表明，miRNA在多种作物针对多种病原菌的抗病过程中起重要的调节作用。运用miRNA序列调控作物自身基因来达到防治玉米褪绿斑驳病毒的应用性研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗玉米病毒的小RNA，其为miR167。本专利技术的另一目的在于提供该miRNA在提高植物抗MCMV侵染中的用途。本专利技术首先发现一种miRNA在玉米褪绿斑驳病毒侵染玉米过程中的表达量发生明显变化，该miRNA为miR167。miR167由玉米miR167家族所编码，经过加工形成的成熟体。玉米中有10个编码产生成熟miR167的基因，其产生的成熟序列分别如SEQIDNO.1-10所示。玉米miR167的10个成熟体序列比较参见图1。本专利技术采用的STTM167序列是以zma-miR167a产生的成熟体的反向互补序列设计的。由于该家族产生的成熟体只在3’末端有1-2碱基的差异，原则上STTM序列能够没有差异的结合图1中不同形式的miR167。本专利技术提供了含有玉米miR167的生物材料，所示生物材料为表达盒、表达载体、工程菌、宿主细胞。本专利技术提供了玉米miR167或其表达促进剂或含有玉米miR167的生物材料在提高植物抗病毒能力中的应用。所述的病毒为玉米褪绿斑驳病毒MCMV。本专利技术提供了玉米miR167或其表达促进剂或含有玉米miR167的生物材料在植物种质资源改良中的应用。本专利技术提供了玉米miR167或其表达促进剂或含有玉米miR167的生物材料在制备抗病能力高的转基因植物中的应用。上述应用中，所示的植物均为单子叶植物，优选玉米、高粱、大麦、小麦、水稻、甘蔗、芋头、洋葱、百合或大蒜。上述应用中，所述的病为由玉米褪绿斑驳病毒MCMV侵染及与其他病毒复合侵染所致的植物病害。本专利技术提供了一种提高玉米抗褪绿斑驳病毒感染能力的小分子农药，该农药中含有促进玉米miR167表达的促进剂。所述促进剂为生物制剂或化学制剂。本专利技术还提供了含有检测玉米miR167的特异性引物或探针的试剂盒在筛选培育能够抗玉米致死性坏色病的玉米中的应用。本专利技术采用的检测植株miR167水平的探针根据miR167a的互补序列设计为：5’-tAgaTcaTgcTggCagCttCa-3’(大写字母表示该碱基被LNA修饰，目的提高检测灵敏度)，其中5’和3’都为地高辛标记。通常而言该探针检测的结果表示植株整体的miR167的水平。本专利技术采用的在玉米原生质体内过表达miR167的实验是根据已报道的以水稻miR528前体基因为骨架，把水稻miR528的成熟序列替换为玉米miR167a的成熟序列，并构建到pGD表达载体上。本专利技术在玉米叶片中瞬时沉默miR167后接种MCMV，发现在沉默miR167的玉米中与未沉默miR167的玉米相比，病毒的花叶症状有明显的增强，且MCMV的积累水平明显提高，表现在MCMV基因组RNA水平和外壳蛋白(coatprotein,CP)的蛋白水平提高。说明miR167在玉米中发挥抗MCMV作用。本专利技术通过在玉米原生质体中沉默和过表达miR167。在沉默miR167的原生质体中，MCMV积累增加，而在过表达miR167的原生质体中MCMV积累减少，表明miR167参与玉米抗MCMV的侵染。本专利技术表明miR167可用于培育抗褪绿斑驳病毒的玉米品种，还可用于抗病植物种质资源的改良及遗传育种领域，为绿色防控、培育抗病玉米提供了分子基础，具有良好的市场应用前景。附图说明图1为玉米miR167成熟体序列比较图；灰色阴影表示成熟的miR167的序列(从5’到3’的顺序)，与靶基因互补配对后第10位的剪切位点标注如图，黑色加粗部分表示家族之间变异的碱基；右边标注是产生该成熟体的前体基因的名称。图2为CMV沉默载体RNA2构建示意图。图3为MCMV在沉默miR167玉米植株上的侵染表型。miR167基因的相对表达量、MCMV基因组RNA的相对含量、MCMVCP的相对含量和CP积累量统计结果。图4为沉默miR167促进了MCMV在玉米植株中的复制和增殖统计结果。A为接种14天后，miR167在对照组(CMV-STTM167m)和处理组(CMV-STTM167)第二片叶片中的积累量；B为接种14天后，miR167在对照组和处理组第二片叶片中的相对积累量；C为接种MCMV7天后，MCMV的基因组在对照组和实验组中的积累量；D为接种MCMV7天后，对应的MCMV的CP在对照组和实验组中的积累量。图5为玉米原生质体中沉默和过表达miR167载体构建序列，以及沉默和过表达mi167对MCMV积累的影响。A为构建在玉米原生质体中沉默和过表达miR167的片段；pMDC32-STTM167(实验组)和pMDC32-STTM167m(对照组)片段用于沉默miR167的实验；pGDamiR167(实验组)和pGDamiRgfp(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗玉米病毒的小RNA，其为miR167，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10任一所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗玉米病毒的小RNA，其为miR167，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-10任一所示。


2.含有权利要求所述的小RNA的生物材料，所示生物材料为表达盒、表达载体、工程菌、宿主细胞。


3.如权利要求1所述的小RNA或其表达促进剂或权利要求2所述的生物材料在提高植物抗病毒能力中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的病毒为玉米褪绿斑驳病毒MCMV。


5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的植物为单子叶植物，优选玉米、高粱、大麦、小麦、水稻、甘蔗、芋头、洋葱、百合或大蒜。


6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：周涛，刘学东，刘思佳，陈曦，范在丰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11