一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用技术

一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株及其制备方法和应用，属于微生物领域，该重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202082。本发明专利技术通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术使该重组病毒无法表达W蛋白，拯救的重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株的MDT值为64.8h，ICPI值为1.72，EID

【技术实现步骤摘要】
一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用
本专利技术属于微生物
，具体公开了一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用。
技术介绍
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病，是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中优先防制的一类动物疫病之一。近年来，我国ND呈现出新的流行病学特点：非典型性ND和免疫带毒现象普遍存在，免疫失败时有发生，直接及间接造成的经济损失巨大，ND的防控面临着新挑战，寻求防控ND的新途径已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题(DimitrovKM，等.UpdatedunifiedphylogeneticclassificationsystemandrevisednomenclatureforNewcastlediseasevirus[J].InfectionGeneticsandEvolution,2019,74:103917.)。NDV为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒I型，基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein，NP)、磷蛋白(Phosphorprotein，P)、基质蛋白(Matrixprotein，M)、融合蛋白(Fusionprotein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein，HN)和大分子蛋白(Largeprotein，L)；以及两种非结构蛋白(V和W)。NP、P和L作为内部蛋白参与病毒RNA的转录与复制，形成有活性的mRNA(KhoCL，等.RegionsonnucleocapsidproteinofNewcastlediseasevirusthatinteractwithitsphosphoprotein[J].ArchivesofVirology,2004,149(5):997-1005.)；M蛋白构成囊膜内表面的支撑物，驱动病毒出芽(PantuaHD，等.RequirementsfortheAssemblyandReleaseofNewcastleDiseaseVirus-LikeParticles[J].JournalofVirology,2006,80(22):11062-11073.)；F和HN是形成病毒表面纤突的糖基化蛋白，是决定NDV毒力和致病性的主要因素(RenS，等.Hemagglutinin-neuraminidaseandfusionproteinsofvirulentNewcastlediseaseviruscooperativelydisturbfusion-fissionhomeostasistoenhancemitochondrialfunctionbyactivatingtheunfoldedproteinresponseofendoplasmicreticulumandmitochondrialstress[J].VeterinaryResearch,2019,50(1):37.)。另外，V蛋白能通过多种策略拮抗宿主天然免疫应答(HuangZ，等.NewcastleDiseaseVirusVProteinIsAssociatedwithViralPathogenesisandFunctionsasanAlphaInterferonAntagonist[J].JournalofVirology,2003,77(16):8676-8685.)。然而，目前有关W蛋白的功能及其作用机制并不清楚。NDV仍只一个血清型，但根据F基因高变区的遗传进化分析可将所有毒株分为ClassⅠ和ClassⅡ大类，其中ClassⅠ又可分为3个基因型，ClassⅡ分为至少20个基因型。分子流行病学研究结果表明，我国目前流行的NDV以ClassⅡ中的基因VII型(鸡、鸭、鹅群)为主(潘群兴，等。新城疫不同宿主源分离株的生物学特性[J].江苏农业学报,2011,27(6):1325-1329.)。不同地区、不同时间分离的NDV在抗原性、致病性和毒力存在着差异。
技术实现思路
本专利技术的目的是一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V202082。作为优选的实施方式，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株是通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术获得的。作为优选的实施方式，所述新城疫病毒反向遗传操作技术是以新城疫病毒VII-NJ株为骨架实现的，所述新城疫病毒VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V201945。作为优选的实施方式，所述定点突变技术是通过采用定点突变试剂盒将新城疫病毒VII-NJ株P基因开放阅读框的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达。本专利技术的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，包括以下步骤：步骤一、新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建；步骤二、新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建；步骤三、重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定；步骤四、主质粒pCI-VII-NJ的定点突变；步骤五、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救。作为优选的实施方式，步骤一至步骤三具体包括以下步骤：(1)新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息合成全基因组，在5’端引入单一限制性内切酶SalI和锤头状核酶结构，在3’端引入单一限制性内切酶NotI和丁肝病毒核酶结构，将合成的全基因组序列插入至pCI-neo载体，鉴定正确后将其命名为新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ；(2)新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息，分别合成其NP、P、L基因，在各基因ORF前引入Kozak序列，在NP和P基因序列两端分别引入限制性内切酶HindIII和EcoRI，在L基因序列两端分别引入限制性内切酶NheI和NotI，将合成的NP、P、L基因序列分别插入至pcDNA3.1载体，鉴定正确后将其分别命名为辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L；(3)重组新城疫病毒VII-NJ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202082。/n

【技术特征摘要】
1.一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V202082。


2.根据权利要求1所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株是通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术获得的。


3.根据权利要求2所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，所述新城疫病毒反向遗传操作技术是以新城疫病毒VII-NJ株为骨架实现的，所述新城疫病毒VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：V201945。


4.根据权利要求3所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，所述定点突变技术是通过采用定点突变试剂盒将新城疫病毒VII-NJ株P基因开放阅读框的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达。


5.如权利要求1至4中任意一项所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建；
步骤二、新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建；
步骤三、重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定；
步骤四、主质粒pCI-VII-NJ的定点突变；
步骤五、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救。


6.根据权利要求5所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，步骤一至步骤三具体包括以下步骤：
(1)新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息合成全基因组，在5’端引入单一限制性内切酶SalI和锤头状核酶结构，在3’端引入单一限制性内切酶NotI和丁肝病毒核酶结构，将合成的全基因组序列插入至pCI-neo载体，鉴定正确后将其命名为新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ；
(2)新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息，分别合成其NP、P、L基因，在各基因ORF前引入Kozak序列，在NP和P基因序列两端分别引入限制性内切酶HindIII和EcoRI，在L基因序列两端分别引入限制性内切酶NheI和NotI，将合成的NP、P、L基因序列分别插入至pcDNA3.1载体，鉴定正确后将其分别命名为辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L；
(3)重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定
取BHK-21细胞接种后待细胞生长至70～80％单层时，以磷酸钙转染试剂将主质粒pCI-VII-NJ与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，pCI-VII-NJ、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L的质量比为4:2:1:1，每孔转...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱晶，刘雪，王永山，欧阳伟，王晓丽，马孙婷，诸玉梅，毕振威，夏兴霞，王晶宇，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32