一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株Pba，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19678。将莨菪碱的完全抗原免疫BALB/c小鼠，将高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
莨菪碱是从中药天仙子、洋金花中分离的颠茄生物碱之一，其结构为由莨菪醇和莨菪酸缩合而生成的酯。莨菪碱是副交感神经抑制剂，药理作用似阿托品，但毒性较大，临床应用较少。莨菪碱有止痛解痉功能，对坐骨神经痛有较好疗效，有时也用于治疗癫痫、晕船等。主要用于生化研究，抗胆碱药及检测金的试剂。目前，莨菪碱检测方法主要为仪器检测，常用的有高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析莨菪碱残留物的方法。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测莨菪碱的前提是得到对莨菪碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对莨菪碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。专利技术人尝试通过杂交瘤细胞制备莨菪碱单克隆抗体，但在制备能分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备莨菪碱半抗原和莨菪碱完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出莨菪碱单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的莨菪碱单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对莨菪碱具有较好的亲和力和灵敏度(IC50值为1.03ng/mL)，可以用于建立莨菪碱的免疫学检测方法，检测莨菪碱的残留。本专利技术的技术方案，一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株Pba，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCCNo.19678。莨菪碱单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.19678的杂交瘤细胞株Pba分泌产生。一种分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：(1)设计莨菪碱半抗原与制备莨菪碱完全抗原，将获得的莨菪碱完全抗原配制弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；(2)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中莨菪碱抗体含量高的获得免疫的小鼠；(4)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的莨菪碱完全抗原进行；(5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的培养基为RPMI-1640培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。莨菪碱半抗原，结构简式如下：莨菪碱半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：称取莨菪碱原药、丁二酸酐、三乙醇胺溶于二氯甲烷中，室温搅拌反应，用盐酸终止反应后，调节pH，混合液用二氯甲烷除去杂质，取水层通过制备型高效液相色谱纯化得到高纯度的目标物，浓缩富集后得到白色固体即为莨菪碱半抗原；所述莨菪碱原药结构简式如下：进一步地，具体步骤为：称取莨菪碱原药1.73mmol、丁二酸酐2.6mmol、三乙醇胺2.6mmol溶于10mL二氯甲烷中，室温搅拌反应4h，用1M的盐酸终止反应后，调节pH＝5～6，混合液用二氯甲烷除去杂质，取水层通过制备型高效液相色谱纯化得到高纯度的目标物，浓缩富集后得到莨菪碱半抗原。莨菪碱完全抗原，结构简式如下：莨菪碱完全抗原的制备方法：将莨菪碱半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺NHS及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于N,N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到莨菪碱半抗原溶液，即A液；将血蓝蛋白KLH用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液PBS透析反应液，得到完全抗原。进一步地，具体步骤为：称取2.92mg莨菪碱半抗原，2.6mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺DMF中，室温搅拌反应5min；再加入4.3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，室温搅拌反应6-8h，称为A液；取10mgKLH，用0.01M碳酸盐缓冲液CBS稀释至5mg/mL，称为B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应12h；然后用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到莨菪碱完全抗原。莨菪碱包被原的制备方法，将莨菪碱原药、N,N’-羰基二咪唑CDI溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，常温搅拌反应，得到莨菪碱半抗原溶液，即A液；将鸡卵白蛋白OVA用碳酸盐缓冲液CBS稀释，得到B液；逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，室温搅拌反应12h得到反应液，将反应液用磷酸盐缓冲液PBS透析除去未反应的小分子，得到莨菪碱包被原；所述莨菪碱原药结构简式如下：进一步地，具体步骤为：将2.0mg莨菪碱原药、11.20mgN,N’-羰基二咪唑CDI溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，37℃搅拌反应8h，得到莨菪碱半抗原溶液，即A液；将5mg鸡卵白蛋白OVA用1mL浓度为0.01mol/L的碳酸盐缓冲液CBS稀释，得到B液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株Pba，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCC No.19678。/n

【技术特征摘要】
1.一株分泌莨菪碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株Pba，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏编号CGMCCNo.19678。


2.莨菪碱单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.19678的杂交瘤细胞株Pba分泌产生。


3.莨菪碱半抗原，其特征在于结构简式如下：





4.莨菪碱半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：称取莨菪碱原药、丁二酸酐、三乙醇胺溶于二氯甲烷中，室温搅拌反应，用盐酸终止反应后，调节pH，混合液用二氯甲烷除去杂质，取水层通过制备型高效液相色谱纯化得到高纯度的目标物，浓缩富集后得到白色固体即为莨菪碱半抗原；
所述莨菪碱原药结构简式如下：





5.莨菪碱完全抗原，其特征在于结构简式如下：





6.莨菪碱完全抗原的制备方法，其特征在于：将莨菪碱半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺NHS及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于N,N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌进行反应，得到莨菪碱半抗原溶液，即A液；将血蓝蛋白KLH用碳酸盐缓冲溶液CBS稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用磷酸盐缓冲液PBS透析反应液，得到完全抗原。


7.根据权利要求6所述莨菪碱完全抗原的制备方法，其特征在于具体步骤为：称取2.92mg莨菪碱半抗原，2.6mgN-...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，郭鑫，匡华，刘丽强，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32