胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用，公开了一组可以配合使用的胃蛋白酶原I单克隆抗体，本发明专利技术胃蛋白酶原I单克隆抗体与PGI结合具有高特异性和稳定性，不会与胃蛋白酶原II产生交叉反应，且适用于多种方法学，实现对PGI的高灵敏度、高精密度检测。

【技术实现步骤摘要】
胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用.
技术介绍
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的前体，根据理化性质及免疫原性的差异分为胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原II(PGII)，主要由胃粘膜分泌。胃蛋白酶原无消化酶活性，分泌至胃腔后在胃酸的作用下活化成具有消化活性的胃蛋白酶原。除了主要在消化道行使功能之外，少量的胃蛋白酶原会透过胃粘膜而进入血液循环。血清中胃蛋白酶原的含量能够反映胃液分泌的水平以及胃部粘膜的病理变化，血清中胃蛋白酶原I的含量与胃泌酸腺细胞的功能密切相关，且可用于多种胃部炎症、胃溃疡、胃癌等的快速筛查，具有便捷、经济等诊断优势。目前临床使用的各种胃蛋白酶原I检测方法都依赖于针对胃蛋白酶原I的特异性单克隆抗体。但目前国内缺乏高特异性的PGI抗体的研究，不仅数量有限，在临床应用中不易实现配对，很难满足不同检测方法学的需求，而且，由于PGI和PGI工蛋白在氨基酸水平上具有一定的相似性，利用现有的PGI抗体制备的检测试剂，对PGI工蛋白也有一定的交叉反应性，会对校测结果的准确性产生影响，因此，生产出多种可以配对使用的高特性、且对PGII不会产生交叉反应的抗PGI单克隆抗体，对临床研究有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供抗PGI单克隆抗体，解决与PGII产生交叉反应的问题，实现与PGI的高特异性结合。抗PGI单克隆抗体，其特征在于，包括：如SEQIDNO：1所列的重链可变区CDR1；如SEQIDNO：2所列的重链可变区CDR2；如SEQIDNO：3所列的重链可变区CDR3；如SEQIDNO：4所列的轻链可变区CDR1；如SEQIDNO：5所列的轻链可变区CDR2；如SEQIDNO：6所列的轻链可变区CDR3；上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体A或如SEQIDNO：7所列的重链可变区CDR1；如SEQIDNO：8所列的重链可变区CDR2；如SEQIDNO：9所列的重链可变区CDR3；如SEQIDNO：10所列的轻链可变区CDR1；如SEQIDNO：11所列的轻链可变区CDR2；如SEQIDNO：12所列的轻链可变区CDR3；上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体B。另一方面，本专利技术提供了一种抗原抗体混合物，所述抗原抗体混合物含有抗体A和/或抗体B。优选的，所述抗原抗体混合物为抗体A-PGI-抗体B。上述抗体A和抗体B特异性的结合PGI的不同抗原结合位点，可以配合使用，达到检测PGI的目的。另一方面，本专利技术公开了含有上述抗体A或抗体B的试剂盒。另一方面，本专利技术公开了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价链接的所述抗PGI单克隆抗体。另一方面，本专利技术公开了一种偶联物，由所述抗PGI单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。另一方面，本专利技术公开了所述的抗PGI单克隆抗体和/或所述的结合物和/或所述的偶联物在制备检测PGI表达产品中的应用。有益效果：本专利技术的PGI单克隆抗体不会对PGII产生交叉反应，且能够应用到不同的试剂盒中实现高灵敏度和高精度的检测。附图说明图1：免疫比浊试剂盒加速稳定性试验图；图2：不同方法学临床检测相关性对比图。具体实施例实施例1：小鼠免疫及抗体检测挑选5只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的PG1蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上。筛选血清效价106以上的小鼠，取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。实施例2：单克隆抗体的生产纯化选择两组6-8周BALB/c小鼠，腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向一组小鼠腹腔内注入0.5ml的PG1-A杂交瘤细胞，细胞数量约1×106数量；另一组小鼠腹腔内注入0.5ml的PG1-B杂交瘤细胞。两周之后开始腹水搜集。搜集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体。实施例3：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆采用SouthernBiothech公司的SBAClonotypingSystem-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为：1、用包被液(0.05MpH9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。2、用稀释液(1％BSA，0.1％PBST)按照1∶1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP，IgG1-HRP，IgG2a-HRP，IgG2b-HRP，IgG3-HRP，IgM-HRP，kappa-HRP，lamda-HRP)1∶3000稀释。3、用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取0D450吸光值。经过鉴定，抗体A和抗体B的重链亚型均为IgG1，轻链为Kappa。根据抗体亚型结果，采用基于RACE技术路线的方法克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，使用总RNA提取试剂盒获得杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的SMARTerRACE说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，并扩增目的抗体全长序列。实施例4：检测抗体A和抗体B对PGI蛋白和PGII蛋白的反应性采用间接ELISA的方式检测抗体的交叉反应性。购买的PGI蛋白和PGII蛋白(购自LeeBiosolutions.Inc)用包被液(0.05MpH＝9.5的碳酸盐缓冲液)从600ng/mL梯度稀释，稀释之后取100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。检测时，将各个待检抗体稀释至500ng/mL与抗原进行37℃孵育，并采用HRP标记的山羊抗鼠多抗进行显色，检测峰值的吸光度，结果如下表1所示。表1抗体A和抗体B对PGI和PGII的反应性结果显示，本专利技术抗体A和抗体B对PGI的反应性高于外购1和外购2抗体，抗体A和抗体B与PGII的反应性小于外购1和外购2，说明相比于市面上现存的抗PGI抗体来说，本专利技术的抗体对PGI具有更高的特异性，且与PGII的交叉反应性更小，更适合用于PGI的检测。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗PGI单克隆抗体，其特征在于，包括：/n如SEQ ID NO：1所列的重链可变区CDR1；/n如SEQ ID NO：2所列的重链可变区CDR2；/n如SEQ ID NO：3所列的重链可变区CDR3；/n如SEQ ID NO：4所列的轻链可变区CDR1；/n如SEQ ID NO：5所列的轻链可变区CDR2；/n如SEQ ID NO：6所列的轻链可变区CDR3；/n上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体A/n或/n如SEQ ID NO：7所列的重链可变区CDR1；/n如SEQ ID NO：8所列的重链可变区CDR2；/n如SEQ ID N0：9所列的重链可变区CDR3；/n如SEQ ID N0：10所列的轻链可变区CDR1；/n如SEQ ID N0：11所列的轻链可变区CDR2；/n如SEQ ID NO：12所列的轻链可变区CDR3；/n上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体B。/n

【技术特征摘要】
1.抗PGI单克隆抗体，其特征在于，包括：
如SEQIDNO：1所列的重链可变区CDR1；
如SEQIDNO：2所列的重链可变区CDR2；
如SEQIDNO：3所列的重链可变区CDR3；
如SEQIDNO：4所列的轻链可变区CDR1；
如SEQIDNO：5所列的轻链可变区CDR2；
如SEQIDNO：6所列的轻链可变区CDR3；
上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体A
或
如SEQIDNO：7所列的重链可变区CDR1；
如SEQIDNO：8所列的重链可变区CDR2；
如SEQIDN0：9所列的重链可变区CDR3；
如SEQIDN0：10所列的轻链可变区CDR1；
如SEQIDN0：11所列的轻链可变区CDR2；
如SEQIDNO：12所列的轻链可变区...

【专利技术属性】
技术研发人员：易维京，蒋会会，蔡方琴，赵忠颢，汤定斌，温路新，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50