鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法技术

本发明专利技术公开鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法。当采用液相色谱‑串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，本发明专利技术的鹿胶特征肽的母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或者母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38。本发明专利技术的鹿胶特征肽能够辨识、鉴定鹿胶药材，基于此可建立以特征肽段离子对为指标的高效液相‑串联质谱快速检测方法(HPLC‑MS/MS)。

【技术实现步骤摘要】
鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法本申请是申请日为2018年9月3日，申请号为CN201811021204.8，专利技术名称为鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法的分案申请。
本专利技术属于医药与食品检测
，具体涉及一种用高效液相-串连质谱技术鉴别鹿胶及其制品真伪的检测技术。
技术介绍
鹿胶(亦称鹿皮胶)是由马鹿CervuselaphusLinnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck的皮经熬制加工而成的特殊中药材，具有补肾壮阳，补血止血之功效。《本草纲目》中记载“鹿皮无毒，治一切漏疮，妇女白带，血崩不止，肾虚滑精”。自古以来鹿胶便是人们滋补养身的功能性保健食品，近些年随着生活水平的提高，鹿胶药材及其产品受到了越来越多的关注。由于鹿胶功效显著，价格较贵，原料又相对短缺，市场上出现了采用其它动物皮或杂皮胶违法生产而成的伪品鹿胶，使得目前市场上鹿胶类药材的质量参差不齐、市场秩序混乱，甚至出现了劣药驱逐良药的恶况。但鹿胶现行的药材质量标准十分简单，仅通过鉴别氨基酸类成分或仅通过控制氨基酸成分来进行质量控制，其质量控制缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术，同时由于鹿胶是鹿皮经高温加热熬制而成，其蛋白质已变性破坏，常用的动物类药材鉴定技术DNA-PCR亦无法对此进行鉴别，使得目前鹿胶缺乏有效的真伪鉴别方法。近些年质谱多肽识别技术在动物胶类的鉴定、辨识中的应用越来越广泛。如程显隆等在特征肽段检测技术用于胶类药材专属性鉴别方法研究(中国中药杂志，2015，50(2):104-108)中公开了利用酶切技术及质谱识别技术对阿胶和新阿胶、黄明胶、龟甲胶进行了对比研究，并对特征肽进行检识，建立了几种胶类药材的鉴别方法。CN105842375A公开了一组鉴别阿胶及其制品中驴源性成分的多肽，并利用特征多肽建立了以液质联用的阿胶及其制品的快速鉴定方法。然而，针对鹿胶药材及其制品的质谱鉴别研究尚为空白，且国际上蛋白质序列库中没有鹿胶原蛋白完整的序列库，无法进行完整的谱库检索。因此，基于质谱建立鉴定鹿胶的方法存在困难。
技术实现思路
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术将鹿胶及其它动物胶进行分析，并进行系统的检测、比较、验证后，发现了能够辨识、鉴定鹿胶药材的特征性肽段，可以用于鹿胶真伪的鉴别，避免了当前仅用性状、外观进行鉴别容易出现假阳性的技术缺陷。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种鹿胶特征肽，当采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，所述鹿胶特征肽的母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或所述鹿胶特征肽的母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38。根据本专利技术第一方面所述的鹿胶特征肽，优选地，所述液相色谱-串连质谱的条件包括：以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B；质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V。本专利技术的第二方面，提供一种鹿胶特征肽，其中所述鹿胶特征肽选自序列为SEQIDNo:1或SEQIDNo:2的肽中的至少一种。本专利技术的第三方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物，其包括本专利技术第一方面或第二方面所述的鹿胶特征肽。本专利技术的第四方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括检测第一方面或第二方面所述的鹿胶特征肽的步骤。根据本专利技术第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括以下步骤：(1)待测样品的处理步骤：取待测鹿胶制品，加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C18固相萃取，得到待测样品溶液；(2)采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串连质谱法的条件包括以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B、10-15min，50体积％的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V；(3)如果检测到母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38，则判定所述待测样品包含鹿胶制品。根据本专利技术第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其还优选包括以下步骤：(1’)鹿胶对照溶液的制备：取鹿胶作为对照物，加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C18固相萃取，得到鹿胶对照溶液；(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1’)相同的方式制备得到待测样品溶液；(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串连质谱法，以电喷雾负离子模式，进行多反应监测，选择m/z732.84→875.42、818.40，或m/z675.99→914.46、746.38作为检测离子对进行检测；(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿胶。根据本专利技术第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或几种物质的水溶液。根据本专利技术第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述胰蛋白酶酶解条件包括酶浓度为每100μl样品液中含5μg-20μg，酶解温度为30-40℃，酶解的时间为10-24小时。根据本专利技术第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述多反应监测的裂解电压为120V，且碰撞能量为35V；或者裂解电压为100V，碰撞能量为25V。本专利技术的鹿胶特征肽能够辨识、鉴定鹿胶药材，基于此可建立以特征肽段离子对为指标的高效液相-串联质谱快速检测方法(HPLC-MS/MS)。另外，本专利技术的鉴定方法采用高效液相-串连质谱技术，其检测的灵敏度高，不仅可以用于单一鹿胶的鉴别，还可以辨别标识含鹿胶的制品中是否含有鹿胶成分，扩大了本技术方法的应用范围。附图说明图1为本专利技术一种示例性鹿胶特征肽的质谱离子图。图2为本专利技术另一种示例性鹿胶特征肽的质谱离子图。图3为MRM模式下一种示例性鹿胶特征肽的m/z732本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹿胶特征肽，其特征在于，当采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，所述鹿胶特征肽的母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或所述鹿胶特征肽的母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38。/n

【技术特征摘要】
1.一种鹿胶特征肽，其特征在于，当采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，所述鹿胶特征肽的母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或所述鹿胶特征肽的母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38。


2.根据权利要求1所述的鹿胶特征肽，其特征在于，所述液相色谱-串连质谱的条件包括：
以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B；
质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V。


3.一种鹿胶特征肽，其中所述鹿胶特征肽选自序列为SEQIDNo:1或SEQIDNo:2的肽中的至少一种。


4.一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物，其包括根据权利要求1-3任一项所述的鹿胶特征肽。


5.一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括检测根据权利要求1-3任一项所示的鹿胶特征肽的步骤。


6.根据权利要求5所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括以下步骤：
(1)待测样品的处理步骤：取待测样品加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C18固相萃取，得到待测样品溶液；
(2)采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串连质谱法的条件包括以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B，质谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，郑云枫，徐浩坤，刘睿，谢宇，
申请(专利权)人：贵州广济堂药业有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州;52