寡聚核酸分子及其应用制造技术

提供了用于治疗脊髓性肌萎缩症的小激活核酸分子及其应用。该小激活核酸分子包含正义核酸链和反义核酸链，正义核酸链和反义核酸链分别为长度为16‑35个核苷酸的寡核苷酸链，并且其中一条核苷酸链与选自靶基因SMN2启动子区的靶点存在至少75%的碱基同源性或互补性。也提供了包含小激活核酸分子和可选地药用载体的药物组合物；以及使用该小激活核酸分子或包含小激活核酸分子的药物组合物上调靶基因在细胞中表达及治疗由靶基因表达不足引起的疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡聚核酸分子及其应用
本专利技术属于核酸
，具体来讲，涉及基因激活相关的寡聚核酸分子及其用途。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)是一种遗传性神经肌肉疾病，表现为进行性的骨骼肌和呼吸肌无力、萎缩，是导致2岁以下儿童死亡的首位遗传疾病。临床上根据发病年龄及病症严重程度分为4种类型，从最重的SMAI型到最轻的SMAIV型(1)。SMA为最常见的儿童期常染色体隐性遗传病之一，在活产婴儿中的发病率为1/11,000，而成人携带者的频率更是高达1/67至1/40(2)，中国人群携带率约为1/42(3)。SMA是由于SMN1(运动神经元生存蛋白1，survivalofmotorneuron1)基因突变引起的，同时SMA患者携带拷贝数不等的高度同源的SMN2基因(4；5)。SMN2和SMN1基因均位于染色体5q13区域，编码同一个被称为运动神经元生存蛋白(survivalofmotorneuron)(SMN)的蛋白质，与SMN1基因相比，SMN2基因有11个核苷酸位点有别于SMN1，其他序列完全相同。该11个核苷酸中只有一个核苷酸出现于SMN2的蛋白编码区，即7号外显子的第6位核苷酸的C被T替代(C6T)，而该区域为外显子的剪接增强子区。这一替代并不改变蛋白编码序列，但影响SMN2第7号外显子的有效拼接，导致大部分的SMN2的前体信使RNA(pre-mRNA)在拼接时遗漏掉7号外显子，翻译成大量不稳定的突变SMN蛋白(SMNΔ7)和少量正常功能的全长SMN蛋白(5；6)。因此，在SMA病人中，由SMN2产生的少量全长SMN蛋白的功能不足以代偿SMN1突变导致的SMN蛋白缺失。因此，任何能够增加来自SMN2基因的SMN全长蛋白表达的方法将有可能成为治疗SMA的有效方法。采用小分子化合物或寡核苷酸来改变SMN2基因的剪接，从而增加全长蛋白的表达量，这一剪接调节策略已在动物SMA模型以及临床试验中得到验证(7-11)。其中，反义寡核苷酸Spinraza已于2016年被美国FDA批准为首个用于治疗儿童和成人脊髓性肌萎缩症的小核酸药物。尽管调节pre-mRNA剪接是个有效的治疗策略，但它受到SMN2pre-mRNA可用量的限制，即如果SMN2pre-mRNA本身的表达量恒定或者低下，在该药影响下产生的SMN全长蛋白的量也是有限的。另一个提高SMN蛋白水平的策略是提高SMN2的转录水平，进而增加SMN2全长蛋白的表达。有数据表明，小分子组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor，HDAC抑制剂)通过抑制组蛋白去乙酰化酶能够激活SMN2基因，提高SMN2转录水平，从而产生更多的SMN2pre-mRNA，在SMA动物模型中也表现出良好的药效(12；13)，但在SMA病人中并未获得临床疗效，可能的原因是，小分子HDAC抑制剂在抑制组蛋白去乙酰化酶后导致很多基因的表达上调而不具备针对SMN2启动子的高特异性和高活性(14；15)。本专利技术独辟蹊径，提供了一种通过靶向SMN2启动子而高度特异性激活SMN2转录的小激活核酸分子。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于RNA激活过程的小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)分子，其通过激活/上调SMN2转录，提高全长SMN蛋白的表达量来治疗由全长SMN蛋白缺乏而导致的疾病或状况，如脊髓性肌萎缩症。在本专利技术的一个一方面，提供了小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)分子，其激活或者上调细胞中SMN2基因的表达，所述的小激活核酸分子的一条链与SMN2基因的启动子区的长度为16-35个核苷酸的片段具有至少75％以上的同源或互补，启动子区是指包括转录起始位点上游的2000个核苷酸，从而实现所述基因表达的激活或者上调。具体地，所述小激活核酸分子的一条链与SMN2基因启动子中距转录起始位点-1639至-1481的区域(SEQIDNO:476)、-1090至-1008的区域(SEQIDNO:477)、-994至-180区域(SEQIDNO:478)或-144至-37(SEQIDNO:479)中的连续16-35个核苷酸长度的片段具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性或互补性。更具体地，所述小激活核酸分子的一条链与选自SEQIDNO:315-471的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性或互补性。在本专利技术中，所述小激活核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链结构核酸分子通过RNA激活机制促进SMN2基因在细胞中的表达。小激活核酸的正义核酸片段和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上时，小激活核酸的至少一条链具有长度为0-6个核苷酸的3’突出端，优选情况下两条链具有长度为2或3个核苷酸的3’突出端，突出端的核苷酸优选为dT。当正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上时，优选情况下该小激活核酸分子为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。上述小激活核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为16-35个核苷酸，可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。在一个实施方案中，本专利技术的小激活核酸分子的正义链与选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性，并且其反义链与选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性。具体地，本专利技术的小激活核酸分子的正义链包括选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列，或者由选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列组成，或者是选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列；本专利技术的小激活核酸分子的反义链包括选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸序列，或者由选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸序列组成，或者是选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸序列。本文所述小激活核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的或未经化学修饰的核苷酸，也可以至少有一个核苷酸为化学修饰的核苷酸，所述化学修饰为如下修饰中的一种或其组合：(1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；(3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。本专利技术的化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。两种修饰都能稳定s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小激活核酸分子，所述小激活核酸分子的一条链与SMN2基因启动子中距转录起始位点-1639至-1481的区域(SEQ ID NO:476)、-1090至-1008的区域(SEQ ID NO:477)、-994至-180区域(SEQ ID NO:478)或-144至-37(SEQ ID NO:479)中的任一长度为16-35个核苷酸的连续片段具有至少75％的同源性或互补性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181229 CN 2018116342685一种小激活核酸分子，所述小激活核酸分子的一条链与SMN2基因启动子中距转录起始位点-1639至-1481的区域(SEQIDNO:476)、-1090至-1008的区域(SEQIDNO:477)、-994至-180区域(SEQIDNO:478)或-144至-37(SEQIDNO:479)中的任一长度为16-35个核苷酸的连续片段具有至少75％的同源性或互补性。


根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于包含正义核酸链和反义核酸链，所述正义核酸链和所述反义核酸链含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够激活SMN2基因在细胞中的表达。


根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其中所述正义核酸链和反义核酸链存在于两条不同的核酸链上。


根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其中所述正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上，优选地是发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。


根据权利要求3所述的小激活核酸分子，其特征在于至少一条链具有长度为0至6个核苷酸的3’突出端。


根据权利要求5所述的小激活核酸分子，其特征在于两条链都具有长度为2-3个核苷酸的3’突出端。


根据权利要求2-6任一项所述的小激活核酸分子，其特征在于正义核酸链和反义核酸链的长度分别为16至35个核苷酸。


根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于所述小激活核酸分子的一条链与选自SEQIDNO:315-471的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性或互补性。


根据权利要求8所述的小激活核酸分子，其特征在于其正义链与选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性，并且其反义链与选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性。


权利要求9所述的小激活核酸分子，其特征在于其正义链包括选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列，或选自SEQIDNO:1-157的任一核苷酸序列，并且其反义链包括选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸序列，或选自SEQIDNO:158-314的任一核苷酸。


根据权利要求1-10任一项所述的小激活核酸分子，其中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸。


根据权利要求11所述的小激活核酸分子，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：
(1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；
(3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。


权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子，其激活/上调SMN2基因表达至少10％。


编码权利要求1-10任一项所述的小激活核酸分子的核酸。


权利要求14所述的核酸，其特征在于所述核酸是DNA分子。


包含权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子或权利要求14或15所述的核酸的细胞。


包含权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子或权利要求14或15所述的核酸，和任选地药学上可接受的载体的组合物。


权利要求17所述的组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体包括或选自水性载体、脂质体、高分子聚合物或多肽。


权利要求17或18所述的组合物，其中所述组合物含有1-150nM的所述小激活核酸分子。


治疗个体中由SMN蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病或状况的方法，包括给所述个体施...

【专利技术属性】
技术研发人员：李龙承，姜武林，
申请(专利权)人：中美瑞康核酸技术南通研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32