从奶、初乳和酸乳清或甜乳清中制备高纯度乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法技术

一种从一来源物质中制备包含乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的馏分的方法所述来源物质含有这些蛋白中至少一种，其中该来源选物质自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，通过具有阳离子交换特性的整体柱的色谱分离工艺，其中在分离工艺中，在将来源物质上样到该柱后采用pH梯度或pH和盐梯度联合洗脱。进一步公开的是一种物质组合，其包括C值＞60％、A值＞1％的乳铁蛋白或乳过氧化物酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从奶、初乳和酸乳清或甜乳清中制备高纯度乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法本专利技术涉及一种从含有这些蛋白质中至少一种的来源物质制备包含乳铁蛋白或乳过氧化物酶的馏分的方法，以及高纯度的乳铁蛋白或乳过氧化物酶蛋白质。
技术介绍
乳铁蛋白(LF)和乳过氧化物酶(LPO)是存在于奶、乳清和初乳中的功能性小蛋白。LF是一种80kDa的糖基化蛋白，可以对各种生理和环境变化作出反应，因此被认为是宿主第一道防线的关键成分。除了所有转铁蛋白共有的Fe3+自身稳态平衡功能外，LF的结构特点还提供了以下功能：针对广谱的细菌、真菌、酵母、病毒和寄生虫具有很强的抗菌活性；抗炎和抗致癌活性；以及一些酶的功能[1]。LPO在保护哺乳期乳腺和新生儿肠道免受病原微生物侵害方面发挥着重要作用，参与各种致癌物的降解和保护动物细胞免受过氧化作用的影响[2]。LF能够与铁结合。天然LF包括15-20％的含铁(Holo)LF，其中含有铁。剩下的部分是不含铁(apo)LF，它不含铁[32]。从理论上讲，apoLF的铁饱和度相当低(已经结合的铁-A值)。apoLF的理论A值约为<3％。此外，apoLF拥有较高的铁结合潜力(铁容量-C值)。apoLF的C值约为>50％。高纯度和非变性的apoLF有可能具有更高的C值，＞70％。另一方面，holoLF拥有高A值(>50％)和低C值(<10％)。分离的LF的C值越高，LF的铁结合潜力就越高。较高的铁结合潜力会导致较高的抗菌活性，因为活性LF会去除微生物生长所需的基本铁。目前，LF和LPO是通过许多不同的技术从奶和奶加工副产品(如乳清)中分离出来的，例如：(I)用带有肝素配体的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)顺磁颗粒分离[3]，(II)通过使用阳离子表面活性剂(例如，十六烷基二甲基溴化铵)[4]，(III)不同的色谱技术(例如，阳离子交换或亲和色谱)[1,2,5-10]以及(IV)其他技术(例如，疏水离子液体[11])。一般来说，色谱技术，最重要的是离子交换色谱，代表了一种如何以相对较低的成本快速分离LF的方法[12]。色谱方法也因其稳健性和可重复性而优于其他方法。在LF和LPO的色谱纯化中最常见的技术是使用强阳离子交换树脂颗粒和膜或整体柱[13-15]。目前的色谱法存在着一些缺点。(I)由于孔隙中的扩散传质，随着流速的增加，色谱峰会变宽，所以当流速增加时，为了获得相同的分辨率，梯度斜率必须变浅；(II)流量增加会减少色谱步骤的时间，但同时会增加洗脱量；(III)柱子长度会导致高柱压降，这是流速的一个限制因素。在色谱纯化步骤中，奶或乳清中的LF和LPO在一定条件下与强阳离子交换剂的表面结合，然后用高pH值或高盐浓度的缓冲液收集洗脱部分。为了简化分离过程，LF和LPO最常使用几种高离子强度或pH>9的缓冲溶液的阶梯(step)模式进行洗脱。这种方法通常会在一个色谱步骤中产生相对较高纯度(60-95％)的所需蛋白质馏分。为了去盐、浓缩和提高纯度，通常会引入超滤过程，以消除少量低分子量的杂质。获得的浓缩蛋白通常通过冻干或喷雾干燥进行干燥。Wang等人[18]表明，冻干的LF比喷雾干燥的(≈5％)含有更少的水(约2-3％)，相反，喷雾干燥的LF显示出稍低的变性程度和高出6-7％抗氧化活性，这与新鲜液体LF接近。喷雾干燥[1]无疑可用于生产具有完整分子构型和高抗氧化能力的无定形LF粉末。EP0418704A1[19]描述了使用离子交换色谱柱分离、纯化和回收能够结合铁的奶蛋白的过程，该色谱柱含有表面有磺酸基的树脂颗粒。LF是通过pH/电导率阶梯洗脱模式分离的，据称最终产品的纯度大于90％。同时，需要一个超滤过程来消除少量的低分子量杂质，最终使LPO和LF的纯度达到90％或更高。在EP1466923A1[20]中描述的工艺包括用强酸阳离子交换树脂(颗粒)的色谱步骤，其中分离的LF的纯度在79％至91％之间。WO2006/119644A1[21]描述了一种纯化LF的方法，使其在溶液中稳定并提高其活性。该方法旨在对已经分离的低纯度LF进行进一步的纯化。纯化是在含有一定浓度的带电排斥溶质的酸性水溶液中使用疏水吸附剂(颗粒)进行的。获得的LF最终纯度＞95％。US5,861,491A[13]公开了分离人类LF的方法，包括通过表达编码重组人类LF(rhLF)的转基因产生的人类LF，以及从奶(通常来自牛乳)中分离其他相关的LF物种。一般来说，奶或含有hLF的奶馏分在相对较高的离子强度下与强阳离子交换树脂接触，以防止非LF蛋白和其他物质与强阳离子交换树脂结合。之后通过离心将树脂颗粒从奶中分离出来，然后使用具有不同盐浓度的少量缓冲溶液以阶梯模式洗脱与阳离子交换树脂结合的LF。HLF和bLF顶级馏分的纯度超过约95％。EP0348508B1[22]公开了使用磺化交联的多糖树脂(颗粒)从生乳中分离LF的方法。吸附在柱子上的LF用NaCl浓度增加的缓冲液以阶梯模式洗脱。经测量，牛LF的纯度为95％，而从脱脂的人初乳中获得的LF纯度为98％。US6,096,870A[23]中描述的方法与乳清蛋白(免疫球蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、LF)的分离有关，特别是使用带有强阳离子交换树脂颗粒的预填充色谱柱将乳清蛋白顺序分离成独立的馏分。所提到的蛋白质组分的顺序洗脱是用适当的pH值和离子强度的缓冲剂以逐步的模式实现的。最终喷雾干燥产品的纯度为：免疫球蛋白≧80％，BSA和LF≧75％，β-乳球蛋白≧85％。US8,603,560B2[24]描述了使用填充在色谱柱中的阳离子交换树脂从奶或乳清中分离奶蛋白质的方法。通过逐步改变pH值或离子强度来促进洗脱。最终LF纯度为80％。CA2128111C[25]描述了在工业规模上从奶和奶产品中分离LF和LPO的方法。通过将所述蛋白质吸附在阳离子交换器上，用一种或多种盐溶液阶梯洗脱，分别或同时洗脱这些蛋白质，从而实现分离。目前还没有关于分离的蛋白质最终纯度的数据。EP0253395B9[26]公开了一种使用弱酸性阳离子交换树脂从奶中分离出高纯度的牛LF的方法。通过用不同浓度的氯化钠溶液逐步洗脱，从离子交换器中回收LF。根据之前的Laurell方法，生产的LF的纯度被测量为高达90-99％。US5,596,082A[27]披露了一种在工业规模上从奶和奶制品中分离LF和LPO酶的方法。该方法包括将奶或奶衍生物通过阳离子交换器，将这些蛋白质吸附到阳离子交换器上的步骤。通过使用不同浓度的盐进行阶梯洗脱，促进上述蛋白质的洗脱。LPO和LF的最终纯度分别高达93％和94％。US9,115,211B2[28]中披露的专利技术描述了一种利用阳离子交换树脂分离LF的方法。通过所述方法获得的LF纯度超过95％，基本上不含LPS、内毒素和血管生成素，铁的饱和度在9％到15％之间。EP2421894A1[29]描述了一种制备低铁LF的方法，其铁饱和度低于10％，或者更优选的是铁饱和度约为9％至3.89％。与标准LF相比，由该工艺生产的这种低本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从一来源物质中制备包含乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的馏分的方法，所述来源物质含有这些蛋白中的至少一种，其中所述来源物质选自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，采用具有强阳离子交换性能的整体柱的色谱分离工艺，在所述分离工艺中，在将所述来源物质上样至所述柱后采用pH梯度或pH和盐梯度组合洗脱。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181106 EP 18204674.81.一种从一来源物质中制备包含乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的馏分的方法，所述来源物质含有这些蛋白中的至少一种，其中所述来源物质选自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，采用具有强阳离子交换性能的整体柱的色谱分离工艺，在所述分离工艺中，在将所述来源物质上样至所述柱后采用pH梯度或pH和盐梯度组合洗脱。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH梯度在约4.0到约<pH8.0的pH范围内开始。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，pH梯度在约pH8至pH<13的范围内终止。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在将所述来源物质上样至色谱柱之前，对所述来源物质进行过滤。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在约为5至55mS/cm的范围内的较高电导率，pH值为约pH8至约pH值<11的范围内，特别是约为pH8.9至pH10或约pH6.6至pH7.5，收集洗脱的馏分A。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在约为5至55mS/cm的范围内的较高电导率，在pH值为约pH＞10.4至约12，特别是约pH>11至约11.7，或约pH9.6至约10.7，收集洗脱的馏分B。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，色谱分离过程包括以下步骤
(i)将来源物质的pH值调整到低于pH7，特别是低于pH6.5的数值；
(ii)使步骤(i)的所述来源物与具有强阳离子交换性能的整体柱接触；然后
(iii)让pH梯度缓冲液流经该柱，从而提高pH值；以及
(iv)收集馏分A，该馏分在约5至55mS/cm的高电导率范围内，约pH8至约pH<11，特别是约pH8.0至约pH10，优选约pH8.2至约pH10，更优选约pH8.9至约pH10，或约pH6.6至约pH7.5的pH范围内洗脱，通常含有乳过氧化物酶；和/或
(v)收集馏分B，该馏分在...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·凯特，B·洛卡尔，M·Z·贾斯汀，A·斯特兰卡尔，
申请(专利权)人：安赫尔工程建模有限责任公司，
类型：发明
国别省市：斯洛文尼亚;SI