一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒制造技术

本发明专利技术具体涉及一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒，属于体外核酸分子检测领域。本发明专利技术设计了新型冠状病毒的N基因、ORF1ab基因、E基因和人ACTB基因的引物、探针，可以同时检测新型冠状病毒的靶标基因以及人内参基因，实现新型冠状病毒的双重、三重甚至四重检测。本发明专利技术在42℃、20分钟内可完成扩增，能够有效避免实验过程出现的假阴性问题，反应结果既可以通过实时荧光检测的方式实现，又可结合侧向层析试纸条对检测结果进行肉眼判读。本发明专利技术检测时间短，特异性强，灵敏度高，重复性好，并通过人内参基因的检测实现样本采集、提取和扩增过程中的质量监控，有利于疫情的进一步管控，具有较好的实用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒
本专利技术属于体外核酸分子检测领域，具体为一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2)是2019年年底出现的一种新型病毒，其具有高度的传染性，在短期内迅速造成了世界范围内的广泛传播，现仍是全球面临的公共卫生紧急事件。更为糟糕的是，对于新型冠状病毒肺炎(Novelcoronaviruspneumonia,NCP)患者的治疗,目前的手段仍是对症治疗，没有合适的药物抑制病毒复制。且目前也没有适合各个年龄段人群接种的疫苗，现有疫苗也只适合于18-59岁的健康人，而老人、婴幼儿、高血压、糖尿病、白血病患者以及孕妇等众多群体均不在适合接种的范畴内，恰恰这些人群才是重点防护对象。因此，如何快速、准确的诊断SARS-CoV-2对于当前疫情的防控具有重要意义。然而，针对SARS-CoV-2的检测，目前多采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)。但是，该方法存在一些局限性，如扩增所需时间长(往往需要1.5-2小时，即便是快速PCR也需要1小时左右的扩增时间，通常来说，完成检测需要5-6个小时)且RT-PCR对扩增所需的模板纯度要求高，此外，对操作人员具有很高的要求。重要的是，RT-PCR技术需要精密且昂贵的核酸扩增仪。在资源匮乏地区，核酸扩增仪数量少甚至缺乏。一旦局部地区爆发疫情，RT-PCR很难达到大规模人群筛查，及时隔离感染者的要求。因此，在全球疫情仍未结束之际，RT-PCR技术不利于疫情再度爆发时大规模的检测，也不符合临床实验室要求的快速、准确发放报告的原则。综上，针对SARS-CoV-2的检测仍有必要开发出更加简单、快速的检测方法。重组酶聚合酶扩增技术是一种恒温扩增技术，可在37-42℃的条件下实现靶标基因的扩增，其扩增结果既可以通过实时荧光定量检测的方式实现，也可以结合侧向层析试纸条对检测结果进行肉眼判读，可满足不同场合的需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，本专利技术的目的之二在于提供一种用于检测新型冠状病毒的实时荧光法检测试剂盒，本专利技术的目的之三在于提供一种用于检测新型冠状病毒的侧向层析试纸条检测试剂盒。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，所述引物组包括用于扩增人ACTB基因的引物对和用于扩增新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因或E基因的引物对中的一种或多种；所述探针组包括用于扩增人ACTB基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、E基因的探针中的一种或多种；所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；所述用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示；所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:36所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:40所示；所述用于扩增人ACTB基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:26所示；所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:21；所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:16；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:45；所述用于检测人ACTB基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:30。作为优选的技术方案之一，所述探针组中的探针有四个修饰位点：在距5’端约30个碱基处、距3’端约15个碱基处使用四氢呋喃及其类似物替代原有碱基，作为核酸外切酶的识别位点；四氢呋喃及其类似物上游的T碱基上标记一个荧光基团，下游的T碱基上标记一个荧光基团对应的淬灭基团，两个基团之间的间距为2-4nt；在3’末端标记阻断探针延伸的阻断基团。作为优选的技术方案之一，所述荧光基团包括FAM、VIC、CY5或ROX。作为优选的技术方案之一，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3。作为优选的技术方案之一，所述阻断基团包括C3-Spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。作为优选的技术方案之一，所述引物组中N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的反向引物用抗原标签1标记，N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的正向引物分别用抗原标签2、3、4、5标记，所述抗原标签1与抗原标签2、3、4、5不相同。作为优选的技术方案之一，所述抗原标签1包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。作为优选的技术方案之一，所述抗原标签2包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。作为优选的技术方案之一，所述抗原标签3包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。作为优选的技术方案之一，所述抗原标签4包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。作为优选的技术方案之一，所述抗原标签5包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。2、一种用于检测新型冠状病毒的实时荧光法检测试剂盒，所述试剂盒包括溶解缓冲液、冻干酶粉、醋酸镁溶液、所述的引物组和探针组；所述溶解缓冲液包括30-50mMTris缓冲液、50-150mM醋酸钾；所述冻干酶粉包括100-500ng/μL重组酶、100-400ng/μL重组酶辅因子、400-900ng/μL单链DNA结合蛋白、50-200ng/μLDNA聚合酶、100-500ng/μL核酸外切酶、50-100ng/μL逆转录酶、1-3mMATP、30-100mM磷酸肌酸、200-300ng/μL肌酸激酶、200-500μMdNTPs、5％-10％w/v聚乙二醇20000、1-5mM二硫苏糖醇。作为优选的技术方案之一，所述试剂盒的使用方法为：1)配置反应体系：29.4μL溶解缓冲液，所述引物组中各基因正向引物、反向引物的终浓度均为200-600nM；所述探针组中各探针的终浓度均为60-180nM，共50μL；2)将配置好的反应体系加入冻干酶粉中，混匀，加入2.5μL28mM醋酸镁溶液于管盖中，离心，实时荧光PCR扩增42℃反应20分钟。3、一种用于检测新型冠状病毒的侧向层析试纸条检测试剂盒，所述试剂盒包括溶解缓冲液、冻干酶粉、醋酸镁溶液、扩增产物稀释液、侧向层析试纸条、羊抗鼠单克隆抗体、抗人ACTB基因抗原标签的单克隆抗体、抗1个或多个所述SARS-Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，其特征在于：所述引物组包括用于扩增人ACTB基因的引物对和用于扩增新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因或E基因的引物对中的一种或多种；所述探针组包括用于扩增人ACTB基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、E基因的探针中的一种或多种；/n所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示；所述用于扩增人ACTB基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；/n所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:21；所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:16；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:45；所述用于检测人ACTB基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:30。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，其特征在于：所述引物组包括用于扩增人ACTB基因的引物对和用于扩增新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因或E基因的引物对中的一种或多种；所述探针组包括用于扩增人ACTB基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、E基因的探针中的一种或多种；
所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；所述用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示；所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:36所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:40所示；所述用于扩增人ACTB基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:26所示；
所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:21；所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:16；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:45；所述用于检测人ACTB基因的探针核苷酸序列为SEQIDNO:30。


2.根据权利要求1所述的引物组、探针组，其特征在于，所述探针组中的探针有四个修饰位点：在距5’端约30个碱基处、距3’端约15个碱基处使用四氢呋喃及其类似物替代原有碱基，作为核酸外切酶的识别位点；四氢呋喃及其类似物上游的T碱基上标记一个荧光基团，下游的T碱基上标记一个荧光基团对应的淬灭基团，两个基团之间的间距为2-4nt；在3’末端标记阻断探针延伸的阻断基团。


3.根据权利要求2所述的引物组、探针组，其特征在于，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3。


4.根据权利要求2所述的引物组、探针组，其特征在于，所述阻断基团包括C3-Spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。


5.根据权利要求1所述的引物组、探针组，其特征在于，所述引物组中N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的反向引物用抗原标签1标记，N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的正向引物分别用抗原标签2、3、4、5标记，所述抗原标签1与抗原标签2、3、4、5不相同。


6.根据权利要求5所述的引物组、探针组，其特征在于，所述抗原标签1包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。


7.一种用于检测新型冠状病毒的实时荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆，尚美云，李进，鲁卫平，苏宁，孙献歌，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：重庆;50