一种血浆外泌体miR-596的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种检测血浆外泌体miR‑596的制剂在制备预测特发性肺动脉高压患者生存率试剂盒中的应用。本发明专利技术首次发现IPAH存活患者和非存活患者血浆外泌体miR‑596的表达不同。血浆外泌体miR‑596可作为一个独立的生存率预测因子，为临床预后和评估患者IPAH的严重程度提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种血浆外泌体miR-596的应用
本专利技术涉及特发性肺动脉高压预后
，尤其涉及一种血浆外泌体miR-596的应用。
技术介绍
特发性肺动脉高压(IPAH)是一种肌性肺小动脉疾病，其特征是肺动脉压力和肺血管阻力(PVR)无明显原因地逐渐升高，最终因右心衰竭而死亡。IPAH诊断的黄金标准是基于右心导管插入术(RHC)的多项血液动力学指标，例如PVR、平均肺动脉压力(mPAP)、平均肺动脉楔压(mPAWP)等。除了诊断价值外，一些血液动力学参数还可用作评估IPAH患者预后的生物标志物。然而，这些参数是通过侵入性检查获得的，需要迫切地挑选出更好的生物标志物。外泌体是一类直径为50-150nm的小细胞外囊泡，来源于与质膜融合的多囊泡内体。分泌的外泌体可被受体细胞吸收，外泌体的内容物也可以传递到受体细胞中，这所代表的一种新型的细胞间通讯途径在疾病发展中起重要作用。微小核糖核酸(miRNA)是外泌体的重要组成部分。许多研究指出，miRNA在IPAH的发生和发展中起着重要作用。Sharma等人确定了源自艾滋病毒感染和可卡因治疗的巨噬细胞的外泌体通过递送miRNA促进了肺平滑肌增殖，这可能在PAH的发展中起着至关重要的作用。虽然外泌体miRNA调控PAH病理过程中的许多关键驱动因素，但血浆外泌体miRNA是否能预测IPAH患者的预后尚不清楚。在本专利中，我们旨在比较存活患者和非存活患者之间血浆外泌体miRNA的表达，研究外泌体miRNA的表达与生存率之间的关系，并为IPAH的临床防治提供最佳预后建议。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血浆外泌体miR-596的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：提供一种检测血浆外泌体miR-596的制剂在制备预测特发性肺动脉高压患者生存率试剂盒中的应用。优选地，所述血浆外泌体miR-596表达水平较低的患者具有较高的生存率。进一步优选地，所述血浆外泌体miR-596表达水平低于2.6的患者具有较高的生存率。优选地，所述预测的敏感性不低于70.6％。优选地，所述预测的特异性不低于92.3％。本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术首次发现IPAH存活患者和非存活患者血浆外泌体miR-596的表达不同。血浆外泌体miR-596可作为一个独立的生存率预测因子，为临床预后和评估患者IPAH的严重程度提供参考。附图说明图1为发现组IPAH患者血浆外泌体和几种外泌体miRNA的特征，其中(A)为透射电子显微镜下的血浆外泌体图像；(B)为通过蛋白质印迹法确定外泌体标记物TSG101和CD63在外泌体中的表达；(C)为外泌体的粒径分布；(D-G)为IPAH患者中几种血浆外泌体miRNA的表达；图2为在发现组和验证组的IPAH患者中，通过实时PCR反应检测血浆外泌体miR-596的表达，其中(A)为发现组血浆外泌体miR-596的表达；(B)为验证组血浆外泌体miR-596的表达；(C)为发现组和验证组血浆外泌体miR-596的表达；图3为Kaplan-Meier生存分析，其中，(A)为miR-596水平预测所有患者的生存率；(B)为PVR水平预测所有患者的生存率；(C)为结合miR-596和PVR水平预测所有患者的生存率；根据miR-596和PVR的临界值对患者进行分组。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不作为本专利技术的限定。实施例①研究人群从2010年5月至2012年4月，招募了12例(5例男性)新确诊的IPAH成年患者作为发现组，从2013年5月至2016年9月，招募了46例(18例男性)新确诊的IPAH成年患者作为验证组。根据欧洲心脏病学会和欧洲呼吸学会当时的指南，对两组患者进行了IPAH诊断。具体而言，两组患者的纳入标准为mPAP≥25mmHg、mPAWP≤15mmHg和PVR>3WU和排除引起PAH的其他原因的患者。排除PAH相关病因明确的患者，例如结缔组织疾病和先天性心脏病，以及因左心疾病所致的肺动脉高压和慢性血栓栓塞性肺动脉高压等其他肺动脉阻塞患者。我们还排除了患有可能影响血浆含量的急性或慢性疾病患者(即急性或慢性感染、慢性自身免疫性疾病和原发性内分泌失调)，以及在研究时或曾经接受显著抑制外泌体产生的药物治疗的患者。该研究方案由上海肺科医院伦理委员会审查和批准。在执行任何与研究相关的程序之前，从每位患者处获得书面知情同意。②基线和随访期间的测量人口统计数据包括性别、年龄、体表面积(BSA)、六分钟步行距离(6MWD)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、世界卫生组织功能分类(WHOFC)和血流动力学参数。如先前的基线研究所述，通过RHC收集血液动力学参数，根据美国胸科学会的指南进行6MWD测试。随访间隔由医生根据个人的医疗保健需求决定。根据ESC指南，鼓励每3-6个月对PAH患者以及病情相对不稳定的患者(疾病进展迅速且控制不佳的患者)进行首次随访，建议每6-12个月通过门诊或电话对控制良好且无明显恶化的患者进行随访。主要结果是全因死亡率。从确诊之日至2020年11月8日对两组进行生存率评估。③外泌体的纯化和鉴定在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血剂试管中收集血样(5mL)，并在4℃下以3000g离心15分钟。然后将上层水相(血浆)转移到试管中并储存在-80℃。储存在-80℃冰箱中的血浆样品将取出用于本研究。在4℃解冻后，使用ExoQuick-TC外泌体沉淀溶液从每个患者的700微升血浆中提取外泌体。利用配备asCMOS照相机的NanoSightNS300(Malvern)分析外泌体的大小分布和浓度。NanoSight应用了NTA技术，结合了光散射和布朗运动，来测量外泌体上清液中颗粒的大小和浓度。在外泌体的整个分离过程之后，首先将沉淀重悬于100μL过滤的PBS中，然后稀释100倍。测量条件包括温度为25℃；粘度为1cP，每个捕获帧25s；测量时间为60s。结果表征为至少三个单独测量的平均尺寸和浓度。如前所述，通过蛋白质印迹法确定外泌体的标记蛋白(TSG101和CD63)。外泌体的蛋白质首先通过SDSPAGE凝胶分离，然后电泳转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore，Billerica，MAandBio-Rad，Hercules，CA)。将膜与TSG101和CD63的多克隆抗体(CellSignalingTechnology，Danvers，MA)在4℃下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血浆外泌体miR-596的制剂在制备预测特发性肺动脉高压患者生存率试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆外泌体miR-596的制剂在制备预测特发性肺动脉高压患者生存率试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血浆外泌体miR-596表达水平较低的患者具有较高的生存率。


3.根据权利要求2所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁平，孙媛媛，袁训涛，王作刚，孙秀英，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31