一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用，涉及生物制药技术领域，所述载体的制备方法包括：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQ ID NO.1；对GV102载体中的限制性酶切位点BamH I和HindⅢ进行酶切，形成线性化GV102载体，所述GV102载体顺序为：hU6‑MCS‑CMV‑GFP‑SV40‑Neomycin；将上两步的产物进行连接构建GV102‑CBS载体。本发明专利技术制备的载体能够显著抑制人CBS基因的表达，达到抑制人甲状腺癌细胞增长、降低癌细胞迁移率的目的，可用于制备治疗人甲状腺癌的制剂之中。

【技术实现步骤摘要】
一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
甲状腺癌（thyroidcarcinoma）是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，属于甲状腺上皮的肿瘤，它包括四种病理类型，分别是乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌。除髓样癌外，大约90%的甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞。乳头状癌为最常见的恶性程度较低、预后较好的一种甲状腺癌。目前国内外对于甲状腺癌治疗的手段主要包括外科手术、促甲状腺素抑制治疗、生物治疗和中药治疗。但是还没有通过制备敲低胱硫醚β合成酶(CBS)基因的相关药物来治疗甲状腺癌的报道。胱硫醚β合成酶(CBS)是一种细胞质中的同源四聚体，由63KD的亚基组成，是一种磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate,PLP)依赖性酶。人类CBS基因编码一种551个氨基酸的蛋白质，由四个63-kDa亚基组成的人CBS活性形式。每个亚单位由三个结构域组成，N端结构域与辅因子血红素结合，这是蛋白质成功折叠和组装所必需的。催化结构域包含另一种辅因子PLP的结合位点。碳末端调节结构域包含两个CBS基序(CBS1和CBS2)，它们二聚形成贝特曼结构域。这个域名负责亚单位四聚化并含有变构激活剂S-腺苷甲硫氨酸的结合位点。在天然的四元结构中，底物进入催化核心的途径被碳末端调节基序封闭，SAM的结合诱导构象变化，从而改善底物进入催化位点的途径。CBS参与了有助于内源性硫化氢(H2S)产生的脱硫反应。CBS主要通过控制半胱氨酸（Hcy）和H2S代谢发挥多种生物学功能，包括线粒体生物能学、氧化还原稳态、DNA甲基化和蛋白质修饰。CBS的去调控和相关的Hcy和/或H2S水平的改变导致心血管、免疫和中枢神经系统的广泛病理紊乱，并导致疾病的发展。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于敲低人CBS基因的shRNA，所述shRNA的具体序列见SEQIDNO.1。本专利技术还提供一种用于敲低人CBS基因的载体，所述载体包含本专利技术所述shRNA。本专利技术还提供一种用于敲低人CBS基因的载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQIDNO.1；具体序列如下：CAAGGTCGGGCAGGAAGAG,TAATACGACTCACTATAGGGS2：对GV102载体中的限制性酶切位点BamHI和HindⅢ进行酶切，形成线性化GV102载体，所述GV102载体顺序为：hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin；S3：将步骤S1和步骤S2的产物进行连接构建GV102-CBS载体。本专利技术还提供一种用于敲低人CBS基因的制剂，所述制剂含有本专利技术所述载体。本专利技术还提供一种本专利技术所述载体在制备治疗人甲状腺癌的制剂中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术制备的载体能够显著抑制人CBS基因的表达，达到抑制人甲状腺癌细胞增长、降低癌细胞迁移率的目的，可用于制备治疗人甲状腺癌的制剂之中。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本专利技术作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1是本专利技术实施例的为CBS过表达质粒和敲低质粒转染进人甲状腺癌细胞后，通过Westernblot检测CBS蛋白表达结果；图2是本专利技术实施例的通过EDU检测细胞增殖能力图；图3是本专利技术实施例的通过平板克隆检测细胞的克隆能力；图4是本专利技术实施例的划痕实验；图5为本专利技术实施例的为软琼脂实验；图6为本专利技术实施例的细胞迁移实验；图7为本专利技术实施例的细胞侵袭实验；图8为本专利技术实施例的通过TUNEL实验检测细胞的凋亡；图9为本专利技术实施例的裸鼠成瘤实验中肿瘤的大小；图10为本专利技术实施例的裸鼠成瘤实验中裸鼠肿瘤的增长趋势；图11为本专利技术实施例的裸鼠成瘤实验中裸鼠肿瘤重量；图12为本专利技术实施例的裸鼠成瘤实验的肿瘤抑制率。其中，Control为野生型细胞，Mock为过表达对照细胞，CBS为基因过表达组细胞，sh-Scb为敲低对照细胞，sh-CBS为基金敲低组细胞，DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，用于显微镜观测，Merge是指两张图片融合。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。主要试剂、药品及样品：人甲状腺癌细胞TPC-1、ARO购自南京科佰生物技术有限公司。转染试剂Lipofectamine3000购自ThermoFisher公司；遗传霉素G418、嘌呤霉素购自索莱宝公司；MTS购自美国Sigma公司；细胞增殖检测试剂盒购自锐博生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购自Corning公司。主要仪器设备：荧光倒置显微镜（型号：ECLIPSETi），购自Nikon公司。实施例1制备敲低人CBS基因的载体一种用于敲低人CBS基因的载体，其制备方法包括：S1：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQIDNO.1；S2：对GV102载体中的限制性酶切位点BamHI和HindⅢ进行酶切，形成线性化GV102载体，所述GV102载体顺序为：hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin；S3：将步骤S1和步骤S2的产物进行连接构建GV102-CBS载体。S4：PCR鉴定，扩增人CBS基因，进行琼脂糖凝胶电泳。S5：阳性克隆测序，鉴定GV102-CBS载体中人CBS基因正确性；实施例2制备过表达CBS基因的载体一种用于过表达人CBS基因的载体，其制备方法包括：S6：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQIDNO.2；具体序列如下：CGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCCACCATGCCTTCTGAGACCCCCCAGGS7：对GV230载体(载体顺序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin)中的限制性酶切位点EcoRI和BamHI进行酶切，形成线性化GV230载体；S8：将步骤S6和步骤S7中产物进行连接构建GV230-CBS载体；S9：PCR鉴定，扩增人CBS基因，进行琼脂糖凝胶电泳；S10：阳性克隆测序，鉴定GV230-CBS载体中人CBS基因正确性。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于敲低人CBS基因的shRNA，其特征在于，所述shRNA的具体序列见SEQ IDNO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于敲低人CBS基因的shRNA，其特征在于，所述shRNA的具体序列见SEQIDNO.1。


2.一种用于敲低人CBS基因的载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述shRNA。


3.一种用于敲低人CBS基因的载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQIDNO.1；
S2：对GV102...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴东栋，李见梅，王迪，祁慧雯，王怡禛，敬米蓉，张艳霞，蔡春波，李彦章，姬新颖，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41