猪RLIM基因的表达抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆重构胚胎发育性能作用的产品中的应用，及在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用。猪RLIM基因的表达抑制剂可以有效提高猪克隆重构胚胎的囊胚率和囊胚时期的胚胎质量，即可以有效提高猪克隆重构胚胎的发育性能，从而可以提高猪体细胞克隆的克隆效率。本发明专利技术所述的猪RLIM基因的表达抑制剂可以选自能抑制猪RLIM基因表达的siRNA，本发明专利技术还提供了3种能抑制猪RLIM基因表达的siRNA。

【技术实现步骤摘要】
猪RLIM基因的表达抑制剂及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及转基因工程技术，具体涉及一种猪RLIM基因的表达抑制剂及其应用。
技术介绍
克隆技术是将一个动物的体细胞核移植入去核的卵母细胞中，重构克隆胚，发育为与供体动物细胞基因完全相同的后代的技术。克隆技术的应用领域十分广泛，如加速繁殖优良畜种和培育转基因品种、利用克隆技术治疗疾病等。并且，在畜牧生产中，与传统育种法相比较，猪体细胞克隆技术可以在短时间内对优良种猪进行快速扩繁，并保持两种基因的稳定及避免优良性状衰退现象，大幅度减少人力、物力和时间成本。尽管克隆技术在包括基因编辑动物、家畜良种扩群等方面取得了巨大的成功，但目前克隆的总体效率仍然很低，在推广和应用的过程中成本较高。在体细胞移植的过程中大多数重构胚都在附植前死亡，即使发育成熟，也有很多异常胚胎，出生的活仔仅占移植的重构胚胎的1％左右。利用克隆技术克隆出的动物多数在胚胎时期出现发育异常，如存在胎盘肥大、胎儿患呼吸疾病等问题，且其成活率普遍低下。同时，与其他的动物的克隆效率相比，猪的克隆效率更低，只有不到1％。克隆成功率低的表观原因有很多，如妊娠早期易流产、是胎盘发育异常、怀孕周期长等，在分子生物学层面的角度，克隆后胚胎的表观修饰异常导致的错误的基因重排被认为是克隆效率低的主要原因。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人在研究解决猪克隆效率低的问题的过程中，发现在X染色体的失活中心区域，还有另一种基因RLIM。RLIM表达产生一种泛素连接蛋白，在整个胚胎发育期间都有所表达并持续发挥作用。在X染色体失活的过程中，RLIM蛋白的表达是Xist基因启动表达的重要影响因子。发现其机制可能是胚胎发育早期RLIM抑制REX1，胚胎发育后期RLIM基因下调，削弱对REX1的控制，从而启动Tsix表达，抑制Xist表达。在猪的克隆胚胎中REX1的表达量也明显低于IVF胚胎。专利技术人通过设计合成RLIM基因的siRNA注射至猪克隆重构胚中，证实了猪RLIM表达抑制剂可以显著猪克隆重构胚胎的发育性能，从而可以提高猪的克隆效率。本专利技术的目的在于提供一种猪RLIM基因的表达抑制剂以及提供猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆重构胚胎发育性能作用的产品中的应用、该表达抑制剂在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用。根据本专利技术的一个方面，提供了一种猪RLIM基因的表达抑制剂，其中，所述抑制剂包括RLIM基因的siRNA。在某些实施方式中，所述的猪RLIM基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述的猪RLIM基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:5-6所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述的猪RLIM基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:7-8所示的核苷酸序列。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用。在某些实施方式中，猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用，该应用中采用的抑制剂为猪RLIM基因的siRNA，该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用，该应用中采用的抑制剂为猪RLIM基因的siRNA，该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:5-6所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用，该应用中采用的抑制剂为猪RLIM基因的siRNA，该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:7-8所示的核苷酸序列。根据本专利技术的再一个方面，提供了一种猪RLIM基因的表达抑制剂在制备提高猪克隆胚胎体外发育性能的产品中的应用。在某些实施方式中，猪RLIM基因的表达抑制剂在制备提高猪克隆胚胎体外发育性能的产品中的应用，该应用中采用的抑制剂为猪RLIM基因的siRNA，该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，猪RLIM基因的表达抑制剂在制备提高猪克隆胚胎体外发育性能的产品中的应用，该应用中采用的抑制剂为猪RLIM基因的siRNA，该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:5-6所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，猪RLIM基因的表达抑制剂在制备提高猪克隆胚胎体外发育性能的产品中的应用，该应用中采用的抑制剂为猪RLIM基因的siRNA，该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:7-8所示的核苷酸序列。根据本专利技术的第四个方面，提供了一种提高猪克隆胚胎体外发育性能的试剂盒，其包括能抑制猪RLIM基因表达的siRNA；该siRNA可以独立包装，也可以与其他物质混合包装，抑制猪RLIM基因表达；该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列或SEQIDNO:5-6所示的核苷酸序列或SEQIDNO:7-8所示的核苷酸序列。根据本专利技术的第五个方面，提供了猪克隆效率的试剂盒，其包括能抑制猪RLIM基因表达的siRNA；该siRNA可以独立包装，也可以与其他物质混合包装，抑制猪RLIM基因表达；该siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列或SEQIDNO:5-6所示的核苷酸序列或SEQIDNO:7-8所示的核苷酸序列。本专利技术的有益效果：1、通过设计和使用靶向猪RLIM基因的siRNA，可以抑制克隆胚胎中RLIM基因和Xist基因的表达。尤其对激活后的猪克隆胚胎重构胚显微注射10pL50μM的RLIMsiRNA-1321(核苷酸序列如SEQIDNO:7-8所示)可以将猪克隆胚胎的体外发育过程中的囊胚率由16.54％提高至23.80％，提高了143.89％倍。实验结果说明在重构胚被激活后对其显微注射RLIMsiRNA-1321可以在4细胞期-桑椹期抑制其RLIM基因表达，进而在桑椹期-囊胚期抑制其Xist基因的异常激活，从而可显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率。2、对激活后的猪克隆胚胎重构胚显微注射10pL50μM的RLIMsiRNA-1321(核苷酸序列如SEQIDNO:7-8所示)可以显著提高克隆猪的出生率，相对于对照组可以由0.87％提高至2.46％，提高了283％倍。附图说明图1为RLIMsiRNA-434、RLIMsiRNA-1125、RLIMsiRNA-1321在猪RLIM基因上所对应干扰片段的示意图；图2为在pk-15细胞上RLIMsiRNA-434、RLIMsiRNA-1125、RLIMsiRNA-1321三种siRNA对猪RLIM基因的干扰效率统计图；图3为对克隆胚胎注射0、0.5、5、50μM的RLIMsiRNA-1321后48h胚胎中RLIM基因的表达量统计图；图4为对克隆胚胎注射50μM的RLIMsiRNA-1321后，胚胎发育过程中，4细胞期-囊胚期的R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪RLIM基因的表达抑制剂，其中，所述抑制剂包括猪RLIM基因的siRNA。/n

【技术特征摘要】
1.猪RLIM基因的表达抑制剂，其中，所述抑制剂包括猪RLIM基因的siRNA。


2.根据权利要求1所述的猪RLIM基因的表达抑制剂，其中，所述的猪RLIM基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的猪RLIM基因的表达抑制剂，其中，所述的猪RLIM基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:5-6所示的核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的猪RLIM基因的表达抑制剂，其中，所述的猪RLIM基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:7-8所示的核苷酸序列。


5.猪RLIM基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆效率的产品中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述猪RLIM基因的表达抑制剂选自权利要求2-4任一项所述的猪RLIM基因的siRNA。


7.猪RLIM基因的表达抑制剂在制备提高猪克隆胚胎体外发育性能的产品中的应用。


8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述猪RLIM...

【专利技术属性】
技术研发人员：李紫聪，吴珍芳，杨柳松，吴霄，蔡更元，洪林君，杨杰，杨化强，郑恩琴，顾婷，徐铮，黄思秀，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44