一种工程菌株及其构建方法和应用技术

本申请公开了一种工程菌株，所述工程菌株为LDP1基因和CALs基因功能灭活的工程菌株ΔCALsΔLDP1。本申请提供了一种通过脂滴蛋白基因的敲除实现对脂滴大小调控的方法。本申请通过基因工程，实现调控脂滴大小并弱化油脂合成代谢途径，为天然产油酵母菌株工程改造，使代谢流更多地流向其他代谢途径，为萜类化合物的合成奠定了基础，将有力促进今后圆红冬孢酵母或其他产油酵母萜类化合物合成的代谢工程研究。

【技术实现步骤摘要】
一种工程菌株及其构建方法和应用
本申请涉及一种工程菌株及其构建方法和应用，属于生物

技术介绍
自然界中存在一类酵母，它胞内能够积累超过自身细胞干重20％的油脂，这类酵母统称为产油酵母(RatledgeC,etal.AdvApplMicrobiol2002,51:1-51.)。圆红冬孢酵母是一株具有广泛应用前景的产油酵母，它能够生产两类具有工业价值的产物-类胡萝卜素与油脂，产量分别可以超过自身细胞干重的0.1％和60％。圆红冬孢酵母中，油脂合成以柠檬酸的裂解产生的乙酰辅酶A为前体，先合成脂肪酸再转化成油脂，主要储存在脂滴中。目前，大家普遍认可脂滴起源于内质网，通过“出芽模型”生成(WaltherTC,etal.AnnuRevBiochem2012,81:687-714.)。内质网上存在许多与油脂合成相关的蛋白，这些蛋白催化生成的中性脂不能与内质网膜上的磷脂互溶，因此不断在磷脂层中的非极性区域积累，积累到一定程度后，内质网膜将其包裹，最终形成新的具有磷脂单分子层的细胞器-脂滴。脂滴从内质网上脱落的同时携带内质网膜上的相关蛋白，我们将其统称为脂滴蛋白。这些脂滴蛋白主要参与细胞代谢、蛋白合成与加工、线粒体功能与膜泡运输等功能。其中，有两个脂滴结构蛋白(类周脂素蛋白Ldp1与油体钙蛋白Cals)，对脂滴形成与结构保持具有重要作用。脂滴作为能量的存储器，普遍存在于胞质中，充当中性脂质储库和脂质代谢的中枢。随着从微生物中提取类胡萝卜素的兴起，红酵母作为一类天然生产类胡萝卜素的菌株逐渐引起了人们的关注。但是，野生型菌株中类胡萝卜素的含量非常低。目前通过基因工程提高β-胡萝卜素产量主要通过过表达类胡萝卜素合成途径中关键基因获得。在圆红冬孢酵母中通过2A序列连接，同时表达来源于三孢布拉霉三个β-胡萝卜素合成基因，得到的工程菌株中β-胡萝卜素的含量可以达到1.7mg/gDCW，相对于野生型菌株提高了4.5倍(JiaoX,etal.FemsYeastRes2018,18(7),foy086)。但是，通过这种操作提高类胡萝卜素产量会受到一定的限制。因为在产油酵母圆红冬孢酵母中，即使过表达类胡萝卜素途径基因，乙酰-CoA前体还是主要流向油脂合成途径。那么通过基因编辑，灭活脂滴结构蛋白Ldp1与Cals，或许可以达到弱化油脂代谢的目的，从而使得代谢流更多的流向萜类合成。因此，有必要提供一种调控脂滴大小并弱化油脂代谢的方法。
技术实现思路
根据本申请的第一方面，提供了一种工程菌株，该工程菌株中脂滴关键蛋白基因LDP1和CALs功能灭活，通过观察脂滴功能缺陷菌株中脂滴大小的变化，进一步揭示脂滴蛋白在油脂合成及储存中的重要作用及对天然产油酵母生长和代谢途径的影响。所述工程菌株为LDP1基因和CALs基因功能灭活的工程菌株ΔCALsΔLDP1。可选地，所述工程菌株ΔCALsΔLDP1的保藏编号为CGMCC：18930。可选地，所述工程菌株ΔCALsΔLDP1为调控出发菌株中LDP1基因和CALs基因的表达后所得。可选地，所述出发菌株为天然产油酵母菌。可选地，所述出发菌株包括圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides。可选地，所述出发菌株为表达Cas9蛋白的工程菌株。根据本申请的第二方面，提供了一种工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：敲除出发菌株基因组中LDP1基因和CALs基因，得到LDP1和CALs功能灭活的所述工程菌株。可选地，所述方法包括：(1)敲除出发菌株基因组中CALs基因，得到工程菌株ΔCALs；(2)敲除所述工程菌株ΔCALs基因组中LDP1基因，得到工程菌株ΔCALsΔLDP1。可选地，所述步骤(1)包括：构建具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的CALs-sgRNA载体；将CALs-sgRNA载体导入表达Cas9蛋白的工程菌株，筛选、培养后得到所述工程菌株ΔCALs；可选地，所述步骤(2)包括：构建具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的LDP1-sgRNA载体；将LDP1-sgRNA载体导入工程菌株ΔCALs，筛选、培养后得到工程菌株ΔCALsΔLDP1。可选地，所述出发菌株为天然产油酵母菌；可选地，所述出发菌株包括圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides。根据本申请的第三方面，提供了一种载体试剂盒，其特征在于，所述载体试剂盒包括具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的CALs-sgRNA载体和具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的LDP1-sgRNA载体中的至少一种。根据本申请的第四方面，提供了根据本申请的第一方面提供的工程菌株或根据本申请的第二方面提供的构建方法构建的工程菌株在调控脂滴大小中的应用。可选地，所述应用包括通过调控工程菌株中LDP1和CALs基因的表达水平来调控脂滴的大小。本专利技术所述工程菌株缺少脂滴合成关键蛋白基因LDP1或CALs，显微镜观察到脂滴功能缺陷菌株中脂滴变化，进一步揭示脂滴蛋白在油脂合成及储存中的重要作用及对圆红冬孢酵母生长和代谢途径的影响，同时提供所述重组菌株的构建方法及应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术中所敲除基因LDP1的详细序列及功能信息等可参见专利CN103965307B中描述。本申请以表达了Cas9蛋白的圆红冬孢酵母NP11-SaCas9作为出发菌株。LDP1基因上选择靶位点进行载体设计，构建载体pZPK-PGPD-NAT-Tnos-U6b-LDP1-sgRNA；CALs基因上选择靶位点进行载体设计，构建载体pZPK-PGPD-HYG-Tnos-U6b-CALs-sgRNA。如上，抗性基因使用GPD启动子及Tnos终止子，靶基因guide序列使用RNA聚合酶III型启动子U6b及sgRNA整合至同一基因元件中。以上sgRNA表达盒，均可通过农杆菌介导转化或电转化方法导入到目的菌株中。本专利技术所述表达SaCas9的NP11工程菌株及敲除盒所用启动子及载体构建方法均可参见文献JiaoX,ZhangY,LiuXJ,ZhangQ,ZhangSF,ZhaoZB.BiotechnolJ，2019,1900036.及专利201910005293.5中记载，线性DNA片段电转化方法可参见文献LiuHD,etal.FEMSYeastRes,2017,17,fox017。本专利技术通过利用特定的酵母内源基因以及外源基因进行基因元件、基因模块的构建，并转入到表达SaCas9的产油酵母基因组上，实现重组菌株油脂合成减少，同时将代谢流导向萜类化合物的生成，提高了类胡萝卜素的产量。其中，所涉及的酵母中的抗性标记、启动子和终止子，包括但不局限于NAT、HYG、GPD、Tnos、U6b，上述基因元件的获得可以红酵母基因组或其它携带相应元件的载体为模板，通过PCR扩增获得或进行人工基因合成；在本专利技术中，上述U6b启动子为圆红冬孢酵母菌株NP11基因组中通过PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为LDP1基因和CALs基因功能灭活的工程菌株ΔCALsΔLDP1。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为LDP1基因和CALs基因功能灭活的工程菌株ΔCALsΔLDP1。


2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株ΔCALsΔLDP1的保藏编号为CGMCC：18930。


3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株ΔCALsΔLDP1为调控出发菌株中LDP1基因和CALs基因的表达后所得；
优选地，所述出发菌株为天然产油酵母菌；
优选地，所述出发菌株包括圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides；
优选地，所述出发菌株为表达Cas9蛋白的工程菌株。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
敲除出发菌株基因组中LDP1基因和CALs基因，得到LDP1和CALs功能灭活的所述工程菌株。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
(1)敲除出发菌株基因组中CALs基因，得到工程菌株ΔCALs；
(2)敲除所述工程菌株ΔCALs基因组中LDP1基因，得到工程菌株ΔCALsΔLDP1。


6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，吕力婷，焦翔，张素芳，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21