樟疫霉效应子蛋白RxLR29及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于樟疫霉的效应子蛋白RxLR29及其编码基因和应用。该蛋白是具有序列表中的SEQIDNO：1的氨基酸残基序列。实验证明，该基因控制表达的蛋白质能够参与樟疫霉侵染本氏烟草的过程，具有抑制植物细胞死亡的功能。本发明专利技术对于充实植物病原卵菌与寄主互作的分子机制资料信息，以及建立植物病原卵菌病害的综合防治技术策略均有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
樟疫霉效应子蛋白RxLR29及其应用
本专利技术属于樟疫霉效应子
，具体涉及一种樟疫霉效应子蛋白RxLR29及其应用。
技术介绍
在与植物的互作过程中，疫霉菌分泌大量的效应子(Effector)来调控植物的生长发育及免疫反应以利于自身的侵染，是疫霉菌分泌到细胞外攻击寄主的关键武器。绝大多数动植物病原物通过各种机制输送分泌效应蛋白到寄主植物细胞内，从而对于寄主细胞的生化、生理过程及细胞代谢等产生显著影响，促进自身的侵染或者激活寄主的防卫反应。效应子基因在植物互作过程中具有重要意义。在长期的协同进化过程中，植物形成了两层防卫机制来抵抗病原菌的侵害。第一层是病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecularpattern,PAMPs)触发的免疫PTI(PAMP-triggeredimmunity,PTI)，即植物体细胞膜表面的受体激酶(PRRs)通过识别病原菌相关的分子模式(PAPMs)来激活植物体的基础防卫系统(PTI)。多数情况下，基础防卫反应可阻断病原菌对植物的侵害。有些病原菌可向植物细胞内分泌效应子蛋白来冲破PTI，这时，植物体通过抗病蛋白识别这些效应蛋白从而激活第二层防卫反应机制，即效应子蛋白激发的防卫机制(Effector-triggeredimmunity,ETI)，激活防卫基因的表达，通常表现为过敏反应(Hypersensitivereaction,HR)，侵染位点细胞凋亡。樟疫霉的破坏性及其分布和宿主广泛性远超过其他疫霉菌，短时间内便可毁灭整片林地。其传入某一地区数年后，引发易感病的中下层寄主林木产生枯梢病或直接死亡，而高度感病的寄主植物在该区域将不复存在。樟疫霉的侵染影响寄主植物的光合作用和气孔的正常功能，大大降低了寄主植物的CO2同化效率，导致寄主植物衰弱甚至死亡及增加了氮沉降，从而加速了全球变暖速率、提高了部分植物对各种病害的敏感性的同时也加强了樟疫霉的破坏力度。全球变暖也加强了温带、热温带的樟疫霉活性，沿海地区尤甚，这导致樟疫霉抗性植物的抗性降低，更易受樟疫霉侵染，同时樟疫霉的宿主范围也可能会增大，从而形成恶性循环。现有技术中报道，樟疫霉效应子蛋白Avh87基因能够抑制凋亡前体蛋白Bax诱导的植物细胞死亡，但是仅一个效应子蛋白对于樟疫霉致病过程仅侵染机理的研究是远远不够的，且不同效应子蛋白的结构也完全不同。综上所述，深入了解樟疫霉的致病过程和侵染机理，针对性的开发新的农药靶标和防治策略，是亟待研究的课题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的在于提供具有抑制植物细胞凋亡的樟疫霉效应子蛋白RxLR29，其可有效抑制植物细胞凋亡。本专利技术还有一目的是提供该蛋白的编码基因及其重组载体，可以用于转基因植物或抑制植物细胞死亡的产品。第一方面，本专利技术提供了樟疫霉效应子蛋白RxLR29，所述蛋白如1)至3)任一所示，1)氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；2)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将1)或2)所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代/缺失/添加，并具有效应子功能的蛋白质。上述RxLR29蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述RxLR29编码基因可通过将序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列缺失一个或几个氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上本领域常用标签的编码序列得到。第二方面，本专利技术提供了编码上述第一方面所述蛋白的核酸分子，所述核酸分子如下a)至b)任一所示，a)核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；b)在严格条件下可与a)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。其中，SEQIDNO：2由444个核苷酸组成，第1-444位为ORF，编码序列表中SEQIDNO：1所示的蛋白质，SEQIDNO：1共由444个氨基酸组成，其中第1-22位氨基酸为信号肽序列。第三方面，本专利技术提供了含有上述第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。在某些实施例中，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以确保整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。在某些实施例中，所述重组表达载体中含有35S启动子。在某些实施例中，所述重组表达载体是在pGR107载体的酶切位点中插入所述RxLR29基因(序列表中SEQIDNO：2)得到的重组质粒。所述具体的酶切位点为SmaⅠ。在某些实施例中，所述表达盒由能够启动所述RxLR29基因表达的启动子，包括所述RxLR29基因以及转录终止序列。所述表达盒由能够启动所述RxLR29基因表达的启动子，所述RxLR29基因，以及转录终止序列组成。第四方面，上述第一方面提供的蛋白或上述第二方面提供的核酸分子，或上述第三方面提供的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用：1)抑制植物细胞死亡；2)制备用于抑制植物细胞死亡的产品。第五方面，本专利技术提供了一种用于抑制植物细胞死亡的产品，其活性成分为第一方面所述的蛋白，或第二方面所述的核酸分子，或第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。在某些实施中，所述植物细胞来源于双子叶植物或单子叶植物。在某些实施中，所述双子叶植物为烟草，更加具体的为本氏烟(NicotianaBenthamiana)。所述RxLR29蛋白具体为将序列表中序列表中SEQIDNO：2所示的全部DNA片段插入到pGR107载体的酶切位点SmaⅠ之间后表达得到的蛋白。同时以农杆菌GV3101为宿主、利用PVX病毒表达载体对该基因进行瞬时表达，采用注射接种法接种本氏烟草(Nicotiana.Benthamiana)，证明了效应子蛋白RxLR29具有抑制植物组织细胞死亡乃至使受害部位产生明显坏死症状的功能。相比于现有技术，本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.樟疫霉效应子蛋白RxLR29，其特征在于，所述蛋白如1)至3)任一所示，/n1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；/n2)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；/n3)将1)或2)所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代/缺失/添加，并具有效应子功能的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.樟疫霉效应子蛋白RxLR29，其特征在于，所述蛋白如1)至3)任一所示，
1)氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；
2)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
3)将1)或2)所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代/缺失/添加，并具有效应子功能的蛋白质。


2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子如下
a)至b)任一所示，
a)核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
b)在严格条件下可与a)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。


3.含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。


4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组过表达载体或重组克隆载体。

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【专利技术属性】
技术研发人员：戴婷婷，李亚星，焦彬彬，吴翠萍，陈贞鹏，徐洁莹，周紫薇，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32