本发明专利技术涉及一种多功能交联剂及其制备方法和应用，属于有机合成技术领域。本交联剂具有生物素富集单元，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；具有偶氮二苯基化学断裂单元，实现交联剂富集后的高效且温和的释放，提高质谱数据鉴定精准度；具有琥珀酰亚胺酯结构单元，生理条件下与蛋白质、多肽赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应，实现蛋白质的化学交联；具有光活性基团，实现真实的细胞原位蛋白质结构及相互作用信息的解析。本发明专利技术交联剂应用于细胞质膜蛋白质组学领域，为实现细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析、细胞质膜蛋白质‑蛋白质相互作用解析提供重要的技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
一种多功能交联剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种多功能交联剂及其制备方法。本专利技术交联剂具有生物素富集单元、偶氮二苯基化学可断裂单元、琥珀酰亚胺酯单元、磺酸钠基团以及光活性基团。其中，光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。该专利技术属于有机合成
技术介绍
蛋白质，作为生物体内各项生命活动的主要承担者，受到研究学者的广泛关注。蛋白质与蛋白质间发生相互作用(protein-proteininteractions,PPIs)，形成精致的、动态的调控网络完成各项复杂的生命过程，同时伴随着自身构象的变化。因此，研究蛋白蛋白相互作用、蛋白复合物的空间构象对于了解蛋白质功能、解释和预测各种生命现象起着至关重要的作用(Analyticalchemistry,2019,91:6953-6961.)。细胞质膜蛋白在细胞的增殖分化、能量转换、信号转导及物质运输等方面发挥着重要的作用。目前，大多数药物治疗靶点定位在细胞质膜蛋白，因此研究细胞质膜蛋白相互作用对于生命科学、临床医学、药物开发等领域具有极其重要的意义(Naturecommunications,2019,10:3131；Science,2018,362:829-834.)。近几年，化学交联质谱技术在研究蛋白相互作用领域扮演着重要角色。相比传统技术如酵母双杂交、免疫共沉淀、核磁共振、X射线衍射等，化学交联质谱技术具有独特的优势，如适用于复杂的样品体系(亚细胞器、细胞、组织等)、能够捕获瞬时和弱的蛋白相互作用、解析生理条件下原位动态的蛋白相互作用等(CurrentopinioninChemicalBiology,2019,48:8-18；Methods,2018,144:53-63；MassSpectrometryReviews,2010,29:862-876；AnalyticalChemistry,2016,88:7930-7937；JournalofProteomeResearch,2017,1:722.)。化学交联质谱技术通常采用双功能的化学交联剂共价结合到相互作用蛋白的界面。常见的功能基团包括琥珀酰亚胺酯(与氨基反应)、马来酰亚胺(与巯基反应)等。然而，细胞质膜蛋白，尤其跨膜区蛋白，含有较多的亮氨酸、异亮氨酸等疏水氨基酸，反应活性基团较少，常规的化学交联剂无法原位捕获跨膜区蛋白的动态空间构象或相互作用信息。而光活性基团如芳基叠氮、二苯甲酮、双吖丙啶具有光引发、反应速率快、反应位点丰富等优点(Chimia,2018,72:758-763；JournaloftheAmericanChemicalSociety,2019,141:11759-11764.)，有望用于细胞质膜蛋白相互作用规模化分析中。
技术实现思路
基于上述化学交联剂的研究现状及设计原则，本专利技术设计并合成了一种多功能交联剂。本专利技术交联剂具有生物素富集单元，通过链霉亲和素富集方式提高交联肽在质谱中的信号强度，降低常规肽段背景干扰，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；具有偶氮二苯基化学断裂单元，实现交联剂富集后的高效且温和的释放，提高质谱数据鉴定精准度；具有琥珀酰亚胺酯结构单元，生理条件下与蛋白质、多肽赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应，实现蛋白质的化学交联；在琥珀酰亚胺酯环上具有磺酸钠单元，一方面提高交联剂的亲水性，另一方面交联剂在溶液中带有负电，抑制交联剂的透膜性，使交联剂定位于细胞质膜，用于研究细胞质膜蛋白的结构信息；具有光活性基团，包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上，紫外光引发即可瞬间发生自由基反应，实现蛋白质的动态结构及相互作用信息的快速捕获，同时减小交联剂对细胞的毒性，实现真实的细胞原位蛋白质结构及相互作用信息的解析。本专利技术提供的多功能交联剂，结构如下所示：其中，R为光活性基团，包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮中的一种或两种以上。具体包含3种结构，如下所示：双吖丙啶为光活性基团的交联剂结构：二苯甲酮为光活性基团的交联剂结构：苯基叠氮为光活性基团的交联剂结构：本专利技术提供了交联剂的制备方法，具体步骤如下：第一步，将生物素、氨甲基苯胺、EDCI、HoBt溶于DMF中，反应物摩尔比为1：1.1：1.3：1.3，加入相对生物素的3-4摩尔当量的DIEA，反应温度控制在20-30℃，反应时间控制在12-24h，除去溶剂，即制得生物素苯胺化合物1。第二步，将化合物1加入相对化合物1的2-3摩尔当量的盐酸，溶于水中，降温至0-5℃，缓慢滴加相对化合物1的1-1.5摩尔当量的亚硝酸钠溶液，0-5℃继续反应0.5-1h，即制备生物素重氮盐；将相对化合物1的1-1.2摩尔当量的3-(Boc氨基甲基)苯酚溶于相对化合物1的3-4摩尔当量的氢氧化钠溶液中，降温至0-5℃，滴加上述的生物素重氮盐溶液；滴加毕，20-25℃反应1-2h，浓盐酸调pH为2-3，减压过滤，即得到生物素偶氮二苯基Boc氨甲基苯酚化合物2。第三步，将化合物2溶于DCM中，10-25℃缓慢滴加相对化合物2的100-200摩尔当量的TFA，继续反应1-2h，减压除去溶剂，即制得生物素偶氮二苯基氨基三氟乙酸盐化合物3。第四步，将三琥珀酰亚胺酯、相对三琥珀酰亚胺酯的1-1.2摩尔当量的化合物3溶于DMSO中，加入相对三琥珀酰亚胺酯的3-4摩尔当量的TEA，20-25℃反应0.5-1h，经过半制备液相分离纯化及真空冻干，冻干温度20-30℃，即制得生物素偶氮二苯基二琥珀酰亚胺酯4。第五步，将化合物4、相对化合物4的1-1.2摩尔当量的光活性基团的氨基盐酸盐溶于DMSO中，加入相对化合物4的3-4摩尔当量的TEA，反应0.5-1h，经过半制备液相分离纯化及真空冻干，冻干温度20-25℃，即制得生物素偶氮二苯基单琥珀酰亚胺酯光活性基团化合物5，其中光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。第六步，将化合物5溶于DMSO中，加入相对化合物5的10-20摩尔当量的TEA及相对化合物5的10-20摩尔当量的水，20-25℃反应24-48h，浓盐酸调pH为2-3，经过半制备液相分离纯化及真空冻干，冻干温度20-30℃，即制得生物素偶氮二苯基单羧基光活性基团化合物6，其中光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。第七步，将化合物6、相对化合物6的1.1-1.5摩尔当量的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐溶于DMSO中，加入相对化合物6的1.5-2摩尔当量的EDCI，20-25℃反应12-18h，经过半制备液相分离纯化及真空冻干，冻干温度20-25℃，即得目标交联剂T.M.，其中光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。本专利技术交联剂应用于细胞质膜蛋白质组学领域，为实现细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析、细胞质膜蛋白质-蛋白质相互作用解析提供重要的技术支撑。与现有化学交联剂相比，本专利技术交联剂具有如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多功能交联剂，其化学结构式为：/n
【技术特征摘要】
1.一种多功能交联剂，其化学结构式为：
其中，R为光活性基团，包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮中的一种或两种以上。
2.一种权利要求1所述的交联剂的制备方法，其特征在于，具体过程如下：
步骤一，生物素、氨甲基苯胺为起始原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDCI)为缩合剂，1-羟基苯并三氮唑(以下简称HoBt)为消旋剂，N,N-二异丙基乙胺(以下简称DIEA)为有机碱，N,N-二甲基甲酰胺(以下简称DMF)为反应溶剂，制备生物素苯胺化合物1；
步骤二，化合物1、3-(Boc氨基甲基)苯酚为反应原料，亚硝酸钠条件，制备生物素偶氮二苯基Boc氨甲基苯酚化合物2；
步骤三，化合物2为原料，三氟乙酸(以下简称TFA)、二氯甲烷(以下简称DCM)为反应溶剂，制备生物素偶氮二苯基氨基三氟乙酸盐化合物3；
步骤四，三琥珀酰亚胺酯、化合物3为原料，三乙胺(以下简称TEA)为有机碱，二甲基亚砜(以下简称DMSO)为反应溶剂，发生一分子的酰胺化反应，制备生物素偶氮二苯基二琥珀酰亚胺酯4；
步骤五，中间体4、光活性基团的氨基盐酸盐为原料，TEA为有机碱，DMSO为反应溶剂，发生一分子的酰胺化反应，制备生物素偶氮二苯基单琥珀酰亚胺酯光活性基团化合物5；其中光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上；
步骤六，化合物5在TEA、DMSO、水体系中，发生水解反应，制备生物素偶氮二苯基单羧基光活性基团化合物6；其中光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上；
步骤七，化合物6、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐为原料，EDCI为缩合剂，DMSO为反应溶剂，制备目标交联剂T.M.；其中光活性基团包括双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。
3.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法，其特征在于：步骤一中将反应物生物素、氨甲基苯胺、EDCI、HoBt溶于DMF中，反应物摩尔比为1：1.1：1.3：1.3，加入相对生物素3-4摩尔当量的DIEA，反应温度控制在20-30℃，反应时间控制在12-24h，除去溶剂，即制得生物素苯胺化合物1。
4.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法，其特征在于：步骤二中将化合物1加入其2-3摩尔当量的盐酸，溶于水中，降温至0-5℃，缓慢滴加相对化合物1的1-1.5摩尔当量的亚硝酸钠溶液，0-5℃继续反应0.5-1h，即制备生物素重氮盐；将相对化合物1的1-1.2摩尔当量的3-(Boc氨基甲基)苯酚...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，高航，赵群，赵丽丽，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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