一种仿生细胞膜纳米粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种仿生细胞膜纳米粒及其制备方法和应用。仿生细胞膜纳米粒包括肿瘤细胞膜囊泡和化疗药物，化疗药物包载在肿瘤细胞膜囊泡内，在肿瘤细胞膜囊泡中负载有光热剂或光敏剂。本发明专利技术中包载的STING激活剂可以激活抗原呈递细胞（APCs）内的STING通路；同时，通过肿瘤细胞膜的同源粘附特性使制剂被肿瘤细胞摄取，在外源激光照射下使光热剂产生高温或者使光敏剂产生单线态氧（ROS）以促进肿瘤相关抗原释放，从而将原发性肿瘤转化为治疗性STING激活疫苗。该治疗性STING疫苗在恶性肿瘤中能产生强大的抗肿瘤功效。

【技术实现步骤摘要】
一种仿生细胞膜纳米粒及其制备方法和应用
本专利技术属于药物制剂
，具体涉及一种通过免疫疗法治疗恶性肿瘤的仿生细胞膜纳米粒及其制备方法和应用。
技术介绍
恶性肿瘤所导致的癌症是当今世界威胁人类健康的一大杀手。常规的癌症治疗方式（手术、放射治疗及化学治疗等）具有相对较高的毒副作用，且选择性差、易于产生耐药性而越发不能满足临床治疗的需要。而肿瘤免疫疗法特异性高，且具有持久应答及长期生存的优势。免疫疗法革命性地改变了传统的肿瘤治疗方法，取得了前所未有的临床疗效。癌症疫苗作为一个新兴研究领域，对癌症能起到有效的预防作用。然而，由于肿瘤内部和肿瘤之间的异质性，以及免疫抑制性肿瘤微环境的束缚，癌症疫苗对肿瘤患者难以产生显著的治疗作用。光热疗法可以通过释放肿瘤相关抗原（TAAs）、损伤相关分子模式（DAMPs）以及促炎细胞因子来诱导肿瘤免疫反应。因此，利用光热疗法促进患者原发性肿瘤抗原释放，从而构建原位肿瘤疫苗，可以实现针对高度异质性肿瘤的个性化治疗。然而，在大多数患者体内，光热疗法的免疫反应也受到免疫抑制性肿瘤微环境的限制。干扰素基因刺激因子（STING）是一种胞质模式识别受体，可以激活先天免疫从而调节肿瘤微环境。STING通路可以分泌I型干扰素以及促炎细胞因子，从而引起抗肿瘤免疫应答。此外，STING通路还可以诱导多方面的炎性反应，包括树突状细胞的成熟以及T淋巴细胞的激活，因而显现出优越的全身免疫效应。因此，免疫细胞的STING信号通路的沉默会导致肿瘤逃避免疫系统监视，从而导致“冷”肿瘤的发生。原位STING激活疫苗（insituSTING-activatingvaccination,ISSAV）策略将原发性肿瘤转变为原位治疗性STING疫苗，诱导了高效、个性化的抗肿瘤免疫应答，这种ISSAV策略代表了一种广谱癌症治疗疫苗，它打破了异质性以及免疫抑制的束缚。通过将光热剂或光敏剂以及STING激活剂联合治疗可为恶性肿瘤的治疗提供一种新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过免疫疗法治疗恶性肿瘤的仿生细胞膜纳米粒，该纳米粒以肿瘤细胞膜制成载体，在其中包裹化疗药物并载入光热剂或光敏剂，通过STING激活剂的STING激活作用以及光热剂的光热治疗作用或光敏剂的光动力治疗作用结合，激活机体免疫，实现对肿瘤侵袭与转移的有效治疗。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种仿生细胞膜纳米粒，包括肿瘤细胞膜囊泡和化疗药物，所述化疗药物包载在肿瘤细胞膜囊泡内；在所述肿瘤细胞膜囊泡中负载有光热剂或光敏剂。进一步地，所述仿生细胞膜纳米粒的粒径为20~500nm。优选为50~300nm。进一步地，所述肿瘤细胞膜囊泡采用B16-F10鼠黑色素瘤细胞的细胞膜、4T1-luc鼠乳腺癌细胞的细胞膜、A549人非小细胞肺癌细胞的细胞膜或HepG2人肝癌细胞的细胞膜制成。进一步地，所述光热剂可以采用二烷基碳菁染料DiR、吲哚绿荧光探针IR780或吲哚菁绿，所述光敏剂可以采用焦叶绿酸己醚、5-氨基酮戊酸或二氢卟吩e6。进一步地，所述化疗药物可以采用MnO2纳米粒、2’-3’环鸟苷酸-腺苷酸、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸、10-羧甲基-9-吖啶酮。优选为MnO2纳米粒。本专利技术中所采用的化疗药物MnO2纳米粒通过以下步骤制备得到：（1）取硫代硫酸钠以及高锰酸钾分别溶于相应溶剂中，之后将其混合并于惰性氛围下搅拌反应，得到MnO2初步沉淀；（2）将步骤（1）得到的MnO2初步沉淀用溶剂进行洗涤，后在高温下干燥，制备得到所述MnO2纳米粒。具体地：步骤1中硫代硫酸钠和高锰酸钾的质量比为1：0.1~10，步骤1与步骤3中所使用溶剂为纯化水。上述仿生细胞膜纳米粒的制备方法，包括以下步骤：（1）从肿瘤细胞中提取肿瘤细胞膜，收集肿瘤细胞并将其悬浮于低渗裂解缓冲液中，使用超声波破碎机进行超声破碎处理，之后使用离心机进行差速离心，从而在上清液中获取肿瘤细胞膜；（2）将步骤（1）中得到的肿瘤细胞膜进行洗涤纯化，使用离心机对肿瘤细胞膜进行离心，弃上清得到肿瘤细胞膜沉淀，使用肿瘤细胞膜洗涤液对肿瘤细胞膜沉淀进行吹打重悬，重复3次，得到纯化的肿瘤细胞膜；（3）为了获得肿瘤细胞膜囊泡，使用超声波发生器对步骤（2）中获得的肿瘤细胞膜进行超声波处理，之后使用微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜进行挤出，从而获得肿瘤细胞膜囊泡；（4）取步骤（3）中得到的肿瘤细胞膜囊泡，加入化疗药物纳米粒，再次使用微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜进行共挤出，制得包载化疗药物的肿瘤细胞膜囊泡；（5）将光热剂或光敏剂溶解于有机溶剂中；（6）在步骤（4）中制得的包载化疗药物的肿瘤细胞膜囊泡溶液中滴加入步骤（5）中得到的溶液，并于37℃下孵育20分钟，之后通过离心除去游离的光热剂或光敏剂，最终获得仿生细胞膜纳米粒制剂。上述仿生细胞膜纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术设计并成功制备了具有免疫疗效的仿生细胞膜纳米粒，以同时递送光热剂或光敏剂以及化疗药物，来达到诱导ICD疗效以及激活cGAS-STING通路之间的协同治疗作用，具有有效的双重水平的抗肿瘤免疫作用。黑色素瘤是高发的皮肤黏膜和色素膜恶性肿瘤，其增长、转移以及复发成为黑色素瘤患者死亡的主要原因。激活免疫以对抗黑色素瘤是治疗以及提高患者生存质量的有效方法之一，在本专利技术中选用了B16-F10细胞（小鼠皮肤黑色素瘤细胞）与B16-F10荷瘤小鼠作为主要模型以评估仿生细胞膜纳米粒抗肿瘤和抗转移的效果。有益效果：1、本专利技术提供了一种通过原位疫苗疗法来治疗恶性肿瘤的仿生细胞膜纳米粒。包载的STING激活剂可以激活抗原呈递细胞内的STING通路；同时，通过肿瘤细胞膜的同源粘附特性使制剂被肿瘤细胞摄取，在外源激光照射下使光热剂产生高温或者使光敏剂产生单线态氧（ROS）以促进肿瘤相关抗原释放，从而将原发性肿瘤转化为治疗性STING激活疫苗。该治疗性STING疫苗在恶性肿瘤中能产生强大的抗肿瘤功效。2、本专利技术采用氧化还原法制备MnO2纳米粒，并通过共挤出的方式制备最终制剂仿生细胞膜纳米粒，制备方法简便。制备的仿生细胞膜纳米粒具有生物相容性高、细胞摄取效率高以及载体毒性低等优点，是具有较高生产性价比且高效低毒的药物制剂。3、本专利技术能简易高效的制备一种高效低毒的通过原位疫苗疗法来治疗恶性肿瘤的仿生细胞膜纳米粒，具有潜在的医用前景。附图说明图1为仿生细胞膜纳米粒（CMM-DiR）的制备及结构示意图。图2为MnO2纳米粒的粒径分布及透射电镜图。图3为仿生细胞膜纳米粒的粒径分布及透射电镜图。图4为仿生细胞膜纳米粒的X射线光电子能谱图。图5为通过蛋白质印迹法对制剂CMM-DiR中肿瘤细胞膜的完整保留的检测。图6为对仿生细胞膜纳米粒释放Mn2+能力的测定结果。具体实施方式本专利技术设计并成功制备了具有免疫疗效的仿生细胞膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤细胞膜囊泡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）从肿瘤细胞中提取肿瘤细胞膜，收集肿瘤细胞并将其悬浮于低渗裂解缓冲液中，使用超声波破碎机进行超声破碎处理，之后使用离心机进行差速离心，从而在上清液中获取肿瘤细胞膜；/n优选：肿瘤细胞密度为1000~20000个/10mL低渗裂解缓冲液；进一步优选：肿瘤细胞密度为5000~10000个/10mL低渗裂解缓冲液；/n优选：超声波破碎机功率优选为50~90%，时间为10~60分钟，超声时长为0.1~2s，时间间隔为0.5~5s；进一步优选：功率为60~70%，时间为15~30分钟，超声时长为0.5~1s，时间间隔为2~4s；/n优选：差速离心法首先以5000~20000g的转速离心10~40分钟，再以100000~200000g的转速离心20~60分钟；进一步优选：差速离心法首先以8000~15000g的转速离心20~30分钟，再以120000~150000g的转速离心30~40分钟；/n（2）将步骤（1）中得到的肿瘤细胞膜进行洗涤纯化，使用离心机对肿瘤细胞膜进行离心，弃上清得到肿瘤细胞膜沉淀，使用肿瘤细胞膜洗涤液对肿瘤细胞膜沉淀进行吹打重悬，重复3次，得到纯化的肿瘤细胞膜；/n优选：离心转速优选为100000~200000g，时间为20~60分钟；进一步优选：离心转速为120000~150000g，时间为30~40分钟；/n（3）为了获得肿瘤细胞膜囊泡，使用超声波发生器对步骤（2）中获得的肿瘤细胞膜进行超声波处理，之后使用微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜进行挤出，从而获得肿瘤细胞膜囊泡；/n优选：超声波发生器功率为1~20W，时间为10~30分钟；进一步优选：功率为5~10W，时间为15~20分钟；/n优选：聚碳酸酯多孔膜孔径为50nm, 100nm, 200nm, 400nm，进一步优选为100nm,200nm。/n...

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞膜囊泡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）从肿瘤细胞中提取肿瘤细胞膜，收集肿瘤细胞并将其悬浮于低渗裂解缓冲液中，使用超声波破碎机进行超声破碎处理，之后使用离心机进行差速离心，从而在上清液中获取肿瘤细胞膜；
优选：肿瘤细胞密度为1000~20000个/10mL低渗裂解缓冲液；进一步优选：肿瘤细胞密度为5000~10000个/10mL低渗裂解缓冲液；
优选：超声波破碎机功率优选为50~90%，时间为10~60分钟，超声时长为0.1~2s，时间间隔为0.5~5s；进一步优选：功率为60~70%，时间为15~30分钟，超声时长为0.5~1s，时间间隔为2~4s；
优选：差速离心法首先以5000~20000g的转速离心10~40分钟，再以100000~200000g的转速离心20~60分钟；进一步优选：差速离心法首先以8000~15000g的转速离心20~30分钟，再以120000~150000g的转速离心30~40分钟；
（2）将步骤（1）中得到的肿瘤细胞膜进行洗涤纯化，使用离心机对肿瘤细胞膜进行离心，弃上清得到肿瘤细胞膜沉淀，使用肿瘤细胞膜洗涤液对肿瘤细胞膜沉淀进行吹打重悬，重复3次，得到纯化的肿瘤细胞膜；
优选：离心转速优选为100000~200000g，时间为20~60分钟；进一步优选：离心转速为120000~150000g，时间为30~40分钟；
（3）为了获得肿瘤细胞膜囊泡，使用超声波发生器对步骤（2）中获得的肿瘤细胞膜进行超声波处理，之后使用微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜进行挤出，从而获得肿瘤细胞膜囊泡；
优选：超声波发生器功率为1~20W，时间为10~30分钟；进一步优选：功率为5~10W，时间为15~20分钟；
优选：聚碳酸酯多孔膜孔径为50nm,100nm,200nm,400nm，进一步优选为100nm,200nm。


2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞膜囊泡的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的低渗裂解缓冲液，包括氯化钾、氯化镁、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以及Tris-盐酸缓冲液；步骤（2）中的肿瘤细胞膜洗涤液为含乙二胺四乙酸的Tris-盐酸缓冲液；步骤（3）中挤出步骤所使用的溶液可以为PBS溶液、Hanks溶液或生理盐水，优选为PBS溶液。


3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞膜囊泡的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙敏捷，杨学，王铮，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32