一种脂肪干细胞冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脂肪干细胞及其应用，属于干细胞冻存技术领域。本发明专利技术所提供的脂肪干细胞冻存液包括40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，100‑250μM肛褶蛙肽。使用本发明专利技术提供的冻存液所长期冻存的脂肪干细胞具有更好的活性和成脂转化能力，而且使用本发明专利技术所提供的冻存液能够有效的降低长期冻存的脂肪干细胞的凋亡。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪干细胞冻存液及其应用
本专利技术属于干细胞冻存
，尤其涉及一种脂肪干细胞冻存液及其应用。
技术介绍
干细胞治疗是生物材料科学和组织工程技术相结合的新型治疗方式。常见的干细胞包括：骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞和外周血间充质干细胞。脂肪间充质干细胞由于更易获得，因此是组织工程中理想的干细胞来源。研究表明，脂肪间充质干细胞不仅具有很强的增殖和分化能力，而且能行向脂肪，骨，软骨，神经，肌肉等方向分化。目前，脂肪间充质干细胞的复苏效率一般不高，该问题严重制约着脂肪间充质干细胞的临床转化和基础研究。因此，制备有效的冻存液来减少冻存过程中脂肪间充质干细胞的损伤对于脂肪干细胞治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脂肪干细胞冻存液及其应用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种脂肪干细胞冻存液，所述冻存液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，肛褶蛙肽。优选地，所述冻存液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，100-250μM肛褶蛙肽。优选地，所述冻存液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，200μM肛褶蛙肽。优选地，所述肛褶蛙肽的氨基酸序列为Asp-Val-Pro-Lys-Ser-Asp-Gln-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2。其次，本专利技术提供了一种用于脂肪干细胞冻存液的多肽，所述多肽为肛褶蛙肽。优选地，所述肛褶蛙肽在脂肪干细胞冻存液中用于维持脂肪干细胞活性；所述肛褶蛙肽在脂肪干细胞冻存液中用于降低脂肪干细胞凋亡；所述肛褶蛙肽在脂肪干细胞冻存液中用于维持脂肪干细胞成脂分化能力。其次，本专利技术提供了肛褶蛙肽在制备脂肪干细胞活性维持剂中的应用。其次，本专利技术提供了肛褶蛙肽在制备脂肪干细胞凋亡抑制剂中的应用。其次，本专利技术提供了肛褶蛙肽在制备脂肪干细胞成脂分化维持剂中的应用。优选地，所述肛褶蛙肽的氨基酸序列为Asp-Val-Pro-Lys-Ser-Asp-Gln-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的脂肪干细胞冻存液能够在长期冻存环境下有效的维持脂肪干细胞的活性并降低脂肪干细胞的凋亡，同时，使用本专利技术冻存液长期冻存的脂肪干细胞能够保持更好的成脂转化能力。附图说明图1实施例1和实施例5冻存细胞中Cleaved-Caspase3和Cleaved-Caspase9的表达水平；图2实施例1和实施例5冻存细胞的成脂转化能力。具体实施方式为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。实施例1（1）按照如下配方配置冻存液A：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO；（2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液A混合，置于冻存盒中于-80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。实施例2（1）按照如下配方配置冻存液B：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，50μM肛褶蛙肽；（2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液B混合，置于冻存盒中于-80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。实施例3（1）按照如下配方配置冻存液C：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，100μM肛褶蛙肽；（2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液C混合，置于冻存盒中于-80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。实施例4（1）按照如下配方配置冻存液D：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，150μM肛褶蛙肽；（2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液D混合，置于冻存盒中于-80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。实施例5（1）按照如下配方配置冻存液E：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，200μM肛褶蛙肽；（2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液D混合，置于冻存盒中于-80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。实施例6（1）按照如下配方配置冻存液F：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，250μM肛褶蛙肽；（2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液D混合，置于冻存盒中于-80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。实验例11.细胞存活率检测（1）在实施例1-6细胞冻存12个月后，置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；（2）取100μl复苏的细胞于1.5ml离心管中，加入100μl台酚蓝染液染色5min，吸取10μl于血球计数板上进行计数，并计算细胞存活率，每组实验重复3次。各实施例冻存细胞的细胞存活率如下表：从上表可以看出，实施例2-实施例6的细胞存活率均高于实施例1，但是实施例2的P值大于0.05，因此无统计学意义。因此，当在现有技术的冻存液中添加100-250μM肛褶蛙肽时，可以显著的提高冻存细胞的活性。其中，尽管相较于实施例5冻存细胞的存活率，实施例6冻存细胞的存活率有一定程度的提升，但是提升无统计学意义，因此，本着节约的原则，本专利技术将200μM肛褶蛙肽作为最适浓度。实施例2凋亡相关蛋白检测（1）在实施例1和实施例5细胞冻存12个月后，置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；（2）离心收集细胞后，添加含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液裂解细胞；（3）冰上裂解30min后，将蛋白裂解液转移到EP管中，低温高速离心机12000rpm离心10min；（4）离心结束之后，将上清转移至新的EP管中，参照BCA法测定蛋白浓度并添加loadingbuffer调整蛋白浓度，95℃煮5min得到蛋白样品；（5）配置12%的分离胶和5%的浓缩胶，安装电泳架，进行点样；（6）点样后，80V至溴酚蓝至分界处，之后，调整电压为120V，一直到溴酚蓝完全跑出；（7）安装电转夹后，调整电转仪参数为恒流250mA电转90min，进行电转，电转结束后将膜取出置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；（8）配置Cleaved-Caspase3，Cleaved-Caspase9和β-actin一抗进行一抗孵育，置于4℃孵育过夜；（9）孵育结束后，回收一抗，使用TBST进行洗膜，洗膜后孵育相应的二抗，置于摇床上，孵育1h；（10）孵育结束后，去除二抗，使用TBST进行洗膜，添加显影液，进行显影。实施例结果如图1，可以看出，相较于实施例1，实施例5的Cleaved-Caspase3和Cleaved-Caspase9的表达量明显较低，说明200μM肛褶蛙肽的添加显著的降低了长期冻存导致的脂肪干细胞细胞凋亡。实施例3成脂转化能力检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：40% DMEM/F12，50%FBS，10% DMSO，肛褶蛙肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，肛褶蛙肽。


2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，100-250μM肛褶蛙肽。


3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，200μM肛褶蛙肽。


4.根据权利要求3所述的冻存液，其特征在于，所述肛褶蛙肽的氨基酸序列为Asp-Val-Pro-Lys-Ser-Asp-Gln-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2。


5.一种用于脂肪干细胞冻存液的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义，滕藤，王仁杰，吴桐，李建玲，安祥程，
申请(专利权)人：山东博森医学工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37