一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统和方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统和方法，属于微生物检测技术领域。所述病原微生物检测系统包括：数据输入模块；数据库存储模块；病原微生物鉴定模块；结果输出模块。利用本发明专利技术的系统和方法，可快速分析样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体。其具有测序读长较长、序列读取快速准确等特点，可实现临床感染POCT检测需求。同时因其长度长的特点，可通过测序数据分析病原体对应的毒力及耐药基因。可有效辅助临床感染诊疗。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统和方法
本专利技术属于微生物检测
，具体地，涉及一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统和方法。
技术介绍
一代测序方法，可通过检测核酸序列，进行生物种类的鉴定，其优点准确性高，缺点是通量低。二代测序方法，也称下一代高通量测序技术(NextGenerationSequencing，NGS)，其可一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，是一组较一代测序通量更高、成本更低、用时更短且自动化程度更高的测序技术。宏基因组(Metagenome)，即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。宏基因组测序(mNGS)用于分析环境样品中存在的所有DNA或RNA信息，从而能够分析整个微生物组。二代测序方法的应用让mNGS研究成为可能，以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，对微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系进行研究。病原宏基因组检测，是一种基于宏基因组测序技术的病原体检测方法。其不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观的检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)，且无需特异性扩增，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。目前以神经系统感染和呼吸系统感染为主要应用方向。由于目前该检测方法一般采用二代测序技术，主要有以下两大难题有待解决：1.分析方法复杂，结果的判断和解读困难。由于NGS检测往往可以得到大量背景或者无关微生物片段，从中寻找或识别责任病原极为关键。2.检测配置中心化和时效性。二代测序技术实验环节对环境要求高，测序仪体积大(多为台式)、成本高，并且需要配备专业的生物信息学分析团队，需要在专业化高的实验室进行，往往以检测中心的形式开展检测项目。实际检测过程需要经过样本采集、运送、收样、实验、上机测序、数据分析、报告出具等众多环节，尤其是从采样地点(通常为医院)到检测中心的样本运送过程占据了较多的时间。有限的检测中心难以临近众多采样地点，运输耗时随着采样地点与检测中心的距离增加而延长，严重影响检测时效性。然而，病原宏基因组测序往往用于急危重症病例，对时效性要求非常高。同时运输过程具有很大的不确定性，容易产生对样本降解、受污染等情况，影响检测质量。纳米孔测序方法，相对于NGS，同样具有高通量的特点，其优势在于测序长度更长(纳米孔测序为几十到数百kb，NGS为数百bp)，测序仪器更小巧(手持式)；其缺点在于碱基错误率高(纳米孔测序碱基错误率为20％左右，而NGS以Illumina测序仪为例，碱基错误率为1％以下)，测序成本较NGS更高。
技术实现思路
为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术第一方面提供一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统，包括：数据输入模块，用于接受样本基于纳米孔测序的原始序列集和样本信息的输入，并用于对所述原始序列集进行质控，得到高质量序列集；数据库存储模块，用于存储病原微生物数据库；病原微生物鉴定模块，分别与数据输入模块和数据库存储模块连接，用于将所述高质量序列集与所述病原微生物数据库进行多次比对，每次比对利用不同的参数，针对每次比对结果，过滤掉不能比对到所述病原微生物数据库的序列，得到不同的比对序列集，所有比对序列集的交集为病原微生物序列集，将病原微生物序列集及其相应的病原微生物信息作为病原微生物鉴定结果；结果输出模块，与所述病原微生物鉴定模块连接，用于输出病原微生物鉴定结果。在本专利技术中，基于纳米孔测序技术的病原微生物检测，具有以下特点：1.其分析原理主要为检出序列与病原数据库序列整体一致性的比对分析，而非单碱基突变的分析，所以，当测序序列更长时，对一致性判断更为有效，其碱基错误率对的判断的影响也会降低；2.当测序长度更长时，经过多种技术层面的优化后，可使其获得高可信度病原序列的几率随之提升，从而使单个样本的所需测序数据量更低，进而使测序成本明显降低；3.同时，随着高可信度病原序列出现几率的提升，背景或者无关微生物片段的比例则会降低，从而降低结果的判断和解读难度。在本专利技术的一些实施方案中，所述基于纳米孔测序的原始序列集是通过以下方法获得的：(1)获得所述样本的核酸样本，并获得高质量的测序文库；(2)基于所述高质量的测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，获得所述基于纳米孔测序的原始序列集。在本专利技术中，所述病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原微生物指寄生虫(原虫、蠕虫、医学节肢动物)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤(1)的具体步骤如下：采用试剂盒进行提取、核酸质检、建立文库，其中，所述建立文库是指：加入内参序列；测DNA两侧先加上A碱基，使平末端变成粘性末端，然后再加上Y接头以及马达蛋白，并对建立的文库进行质检，得到所述高质量测序文库。在本专利技术的一些具体实施方案中，利用NanoporeMinION测序仪进行测序，并利用配套的MinKNOW软件获得所述基于纳米孔测序的原始序列集，以达到控制仪器，测序与实时碱基识别，检测运行状态，数据采集等目的。在本专利技术的一些实施方案中，所述样本信息包括但不限于样本类型、重点关注的物种和文库质量信息。在本专利技术的一些实施方案中，所述数据输入模块根据所述基于纳米孔测序的原始序列集和所述样本信息，参照包括但不限于所述样本类型和所述重点关注的物种而自动选择数据质检方案，并自动调整处理和过滤参数。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述自动选择数据质检方案具体如下：所述样本信息包括但不限于样本类型、检测项目、关注的病原体类型、抗菌素的使用、文库信息，及它们之间的关系；所述数据质检参数，包括但不限于数据量、序列平均长度、最小质量值；将各所述样本信息类型与数据质检参数的对应关系输入数据库；质检前，根据样本信息从数据库中调取对应的数据质检参数，并将同类型的数据质检参数进行整合，得到样本信息对应的最适参数组合，形成数据质检方案。在本专利技术的一些实施方案中，利用fastqc软件对所述基于纳米孔测序的原始序列集进行质检；并利用fastp软件对所述基于纳米孔测序的原始序列集进行质控，过滤不合格的序列，得到所述高质量序列集。任选地，所述质控为质检、低质量碱基过滤和接头过滤。在本专利技术的一些实施方案中，所述病原微生物数据库包括病原微生物参考序列数据库和病原微生物注释数据库。任选地，所述病原微生物参考序列数据库为非关系型的。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述病原微生物参考序列数据库可以是或包括任意本领域技术人员知悉的包含病原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统，其特征在于，包括：/n数据输入模块，用于接受样本基于纳米孔测序的原始序列集和样本信息的输入，并用于对所述原始序列集进行质控，得到高质量序列集；/n数据库存储模块，用于存储病原微生物数据库；/n病原微生物鉴定模块，分别与数据输入模块和数据库存储模块连接，用于将所述高质量序列集与所述病原微生物数据库进行多次比对，每次比对利用不同的参数，针对每次比对结果，过滤掉不能比对到所述病原微生物数据库的序列，得到不同的比对序列集，所有比对序列集的交集为病原微生物序列集，将病原微生物序列集及其相应的病原微生物信息作为病原微生物鉴定结果；/n结果输出模块，与所述病原微生物鉴定模块连接，用于输出病原微生物鉴定结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔测序的病原微生物检测系统，其特征在于，包括：
数据输入模块，用于接受样本基于纳米孔测序的原始序列集和样本信息的输入，并用于对所述原始序列集进行质控，得到高质量序列集；
数据库存储模块，用于存储病原微生物数据库；
病原微生物鉴定模块，分别与数据输入模块和数据库存储模块连接，用于将所述高质量序列集与所述病原微生物数据库进行多次比对，每次比对利用不同的参数，针对每次比对结果，过滤掉不能比对到所述病原微生物数据库的序列，得到不同的比对序列集，所有比对序列集的交集为病原微生物序列集，将病原微生物序列集及其相应的病原微生物信息作为病原微生物鉴定结果；
结果输出模块，与所述病原微生物鉴定模块连接，用于输出病原微生物鉴定结果。


2.根据权利要求1所述的病原微生物检测系统，其特征在于，所述病原微生物数据库包括病原微生物参考序列数据库和病原微生物注释数据库。


3.根据权利要求2所述的病原微生物检测系统，其特征在于，所述病原微生物鉴定结果包括物种信息、物种reads、reads占该物种比例、覆盖度、深度。


4.根据权利要求1所述的病原微生物检测系统，其特征在于，所述病原微生物鉴定模块还对病原微生物鉴定结果进行验证：将所述病原微生物序列集进行在线BLAST比对，利用比对一致性和查询序列覆盖度信息剔除假阳性结果。


5.根据权利要求4所述的病原微生物检测系统，其特征在于，所述BLAST比对为BLASTN比对。


6.根据权利要求2所述的病原微生物检测系统，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚浩，杨仁涛，吴雅欣，陈澎明，王东生，詹太平，蒋华，
申请(专利权)人：美格医学检验所广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44