一种猪脑心肌炎间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种猪脑心肌炎间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法。本发明专利技术所述试剂盒以猪脑心肌炎病毒2A纯化蛋白作为ELISA抗体检测板上的包被抗原。本发明专利技术公开了制备及纯化2A蛋白的方法，即利用猪脑心肌炎病毒HB10株基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后构建原核表达载体pET28a‑2A，再进行诱导表达2A蛋白。本发明专利技术的ELISA诊断方法特异性强，结果稳定可靠，可特异性地检测出猪脑心肌炎病毒抗体，完全适用于猪脑心肌炎病毒感染后的诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种猪脑心肌炎间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及ELISA诊断试剂盒领域，具体涉及一种猪脑心肌炎间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法。
技术介绍
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus，EMCV)是一个无囊膜的单股小RNA病毒。该病毒虽然只有一种血清型，但其宿主范围广泛，可引起某些哺乳动物、啮齿动物乃至人类脑炎、心肌炎为主要特征的急性传染病。其中，猪是最易感的动物，可引起仔猪急性致死性脑炎、心肌炎或心肌周围炎，怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍性疾病，给养猪业带来严重的经济损失；在犬等动物上也有分离报道。由于EMCV是一种重要的人兽共患病病原体，而且猪是人体组织器官移植的重要来源，犬是人类的伴侣动物、与人类接触紧密，故对该人畜共患病病原的致病机制和科学防治研究尤为重要。根据临床症状并结合病理变化和流行病学分析可诊断典型的脑心肌炎病毒，然而对于隐形感染的动物或非典型的病例则缺乏有效的诊断方法，其确诊必须进行实验室诊断。关于脑心肌炎病毒现有的诊断方法还比较少，主要通过病毒粒子的电镜观察、PCR检测、基因组学检测等方法。但这些方法都存在操作繁琐、价格昂贵、灵敏性和特异性不高等缺点。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特异性强等优点现已被广泛应用于许多病原的抗原或抗体的检测。2A蛋白是脑心肌炎病毒重要的毒力因子，也是脑心肌炎病毒致病机制研究的热点。将2A蛋白作为检测重点建立ELISA诊断方法具有重要意义。目前世界上还没有一种稳定而可靠的脑心肌炎病毒血清学诊断方法，这也是当前脑心肌炎病毒防制最急需解决的问题，建立快速而有效的脑心肌炎病毒诊断方法，对于脑心肌炎病毒的防治和根除具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其以猪脑心肌炎病毒2A蛋白作为ELISA抗体检测板上的包被抗原，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，扩增所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的引物如SEQIDNO.1-2所示。本专利技术提供的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的包被量为0.5-1μg/孔；优选地，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的包被量为0.5μg/孔。在本专利技术提供的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒中，还包括羊抗鼠酶标二抗、洗涤液、显色液、终止液。本专利技术提供的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒的检测操作步骤为：(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液稀释，加入ELISA检测板中，孵育后甩干；(3)向每孔加入洗涤液，洗涤后甩干；(4)向每孔加入酶标二抗工作液，孵育后甩干；(5)向每孔加入洗涤液，洗涤后甩干；(6)向每孔加入显色液，避光孵育；(7)向每孔加入终止液，用酶标仪在450nm波长下读取光吸收值。本专利技术提供的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒的检测结果判定标准为：(1)若待检样品OD450≥0.25判定样品为阳性；(2)若待检样品OD450≤0.20判定样品判为阴性；(3)若待检样品0.25＞OD450＞0.20时判定样品为可疑样品；复检所述可疑样品，若可疑样品OD450≥0.23判定可疑样品为阳性，若可疑样品OD450≤0.23判定可疑样品为阴性。本专利技术第二方面提供上述猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒的制备方法，其中所述包被抗原的制备包括：使用SEQIDNO.3所示序列构建原核表达载体pET28a-2A；将所述原核表达载体pET28a-2A转化BL21(Transetta)，挑取阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中培养。在本专利技术所述制备方法中，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的诱导表达方法为在所述BL21(Transetta)菌液OD600达到0.6时，向所述LB培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG，在37℃条件下诱导表达8h，得猪脑心肌炎病毒2A蛋白。采用本专利技术所提供的制备方法，约有80％的猪脑心肌炎病毒2A蛋白呈现可溶性表达。本专利技术还要求保护上述的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒或上述的制备方法在猪防疫检测以及肉猪养殖中的应用。本专利技术的有益效果至少在于：(1)本专利技术的ELISA诊断方法特异性强，结果稳定可靠，可特异性地检测出猪脑心肌炎病毒抗体，完全适用于猪脑心肌炎病毒感染后的诊断；(2)本专利技术所采用的2A重组蛋白于上清中表达，具有有效生物活性，2A基因在pET原核表达系统中可得到稳定而高效的可溶性表达，携带组氨酸标记的重组蛋白易于纯化；(3)、本专利技术的试剂盒结果判定方便、灵敏、准确、可靠，采用TMB底物进行显色，用酶标仪测定OD值，判定待检样品的检测结果；阴阳性结果差异明显，比OPD显色更加灵敏、可靠和稳定；(4)本专利技术的试剂盒操作简便快速，能在1.5h内完成样品检测，耗时短，成本低，非常适合大量动物血清样品的检测。附图说明图1为本专利技术实施例1中所提供引物序列扩增得到的2A基因电泳图；其中泳道1为2A基因的核酸；泳道2为Marker。图2为本专利技术实施例1中所提供引物序列扩增得到的2A重组蛋白电泳图；其中泳道1为Marker；泳道2为载体；泳道3为转化BL21(DE3)的蛋白表达上清；泳道4为转化BL21(DE3)的蛋白表达沉淀；泳道5为转化BL21(Transetta)的蛋白表达上清；泳道6为转化BL21(Transetta)的蛋白表达沉淀。图3为本专利技术对比例1中所提供引物构建原核表达载体得到的2A蛋白；其中泳道1为Marker；泳道2为纯化后的2A重组蛋白；泳道3为纯化前的2A重组蛋白产物；泳道4为IPTG诱导表达pET28a空载体。具体实施方式以下实例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的保护范围。若未特别指明，本专利技术实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本专利技术实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1猪脑心肌炎间接ELISA诊断试剂盒本实施例提供一种猪脑心肌炎间接ELISA诊断试剂盒的制备方法及ELISA诊断试剂盒的特异性实验结果。1、脑心肌炎病毒2A基因的克隆和原核表达载体的构建参考GenBank中JQ864080设计2A基因片段的特异性引物，上游引物：CGGGATCCAGTCCAAATGCCCTAGACAT(SEQIDNO.1)；下游引物：CGCTCGAGttaTTGGGTCTGGAAAACCTGTT(SEQIDNO.2)；通过PCR扩增得到大小为471bp的2A特异性目的基因(如SEQIDNO.3所示)，A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其特征在于，以猪脑心肌炎病毒2A蛋白作为ELISA抗体检测板上的包被抗原，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其特征在于，以猪脑心肌炎病毒2A蛋白作为ELISA抗体检测板上的包被抗原，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其特征在于，扩增所述核苷酸序列的引物如SEQIDNO.1-2所示。


3.根据权利要求1-2任一项所述的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述猪脑心肌炎病毒2A蛋白的包被量为0.5-1μg/孔。


4.根据权利要求3所述的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒中，还包括羊抗鼠酶标二抗、洗涤液、显色液、终止液。


5.根据权利要求4所述的猪脑心肌炎ELISA诊断试剂盒，其特征在于，检测操作步骤为：
(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
(2)将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液稀释，加入ELISA检测板中，孵育后甩干；
(3)向每孔加入洗涤液，洗涤后甩干；
(4)向每孔加入酶标二抗工作液，孵育后甩干；
(5)向每孔加入洗涤液，洗涤后甩干；
(6)向每孔加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔尚金，梁瑞英，梁琳，韩若婵，秦彤，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11